一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，首先，利用番茄来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料糖基化反应合成莱鲍迪苷E；随后，利用甜叶菊来源UDP‑糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以莱鲍迪苷E为原料进一步糖基化反应合成莱鲍迪苷M。本发明专利技术的方法利用分子克隆技术，获得异源表达UDP‑糖基转移酶和蔗糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌，经发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP‑葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。

A Biocatalytic Method for the Synthesis of Lebatidin M

The invention discloses a biocatalytic method for synthesizing lebatidin M. Firstly, lebatidin E is synthesized by glycosylation reaction of stevioside with UDP_glycosyltransferase from tomato and sucrose synthetase from potato. Then, the lebatidin E is further glycosylated with UDP_glycosyltransferase from Stevia and sucrose synthetase from potato. Chenglebaodioside M. The method of the present invention utilizes molecular cloning technology to obtain E. coli genetic engineering bacteria expressing UDP_glycosyltransferase and sucrose synthase heterologously. After fermentation, the enzyme is directly catalyzed by cell crude extract, UDP_glucose is obtained by decomposition of the crude extract and additional sucrose under the action of sucrose synthase, and the double enzyme cycle is established. Cyclic reaction system can effectively catalyze the production of lebatidin M from stevioside. The cost of raw materials is lower and the process is simple, which has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法。
技术介绍
甜叶菊作为一种原产于南美洲的多年本草生植物，其茎叶中可提取出丰富的甜菊糖甙，几个世纪以来，一直被南美洲人们用作为天然甜味剂[1]。自1976年我国从日本引进甜叶菊种植成功后，80年代后开始向全国推广种植。目前福建、安微、江苏等地已有大面积种植，总面积达100万亩，已成为全球最大的甜菊糖生产国和出口国[2,3]。甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250~450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。其溶解度不低，且在酸和盐的溶液中能稳定存在，保存时间长、不会结块。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用[4,5]，因此，越来越受到人们的关注。甜菊糖是甜菊糖甙的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙[6]。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C13位羟基和C19位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C16-C17之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团[6,7]。莱鲍迪苷M，于2009年报道首次从甜叶菊新品种的叶子中被提取鉴定，其甜度为蔗糖的400倍，优于现市场上在售的莱鲍迪苷A，口感也更为干净。尽管研究人员培育了高产莱鲍迪苷M的甜叶菊新品种，但其在干叶片中的含量仍低（~0.4-0.5%），单纯使用物理手段直接从叶片中提取制备高纯度的莱鲍迪苷M，经济效益是及其低下的。专利申请CN201310353500.9（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）与专利申请CN201410019981.4（一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法）中采用的是以莱鲍迪苷A或者莱鲍迪苷D为底物原料，经UDP-葡萄糖基转移酶（来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B）及蔗糖合成酶偶联催化实现的，其底物莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D的成本均远远高于甜菊甙。专利申请CN201410553617.6（莱鲍迪苷M的合成方法及其中间产物和合成方法）和专利申请CN201410314371.7（一种制备莱鲍迪苷M的工艺方法）中均涉及到部分化学试剂或化学反应，且合成步骤烦琐。本方法通过生物酶催化手段，以甜菊甙纯品为原料，搭建新的莱鲍迪苷M合成路径，经两步糖基化反应制备莱鲍迪苷M，原料成本更为低廉，工艺步骤简单，具有重要的应用价值。参考文献[1]杨远志,李发财,琚争艳,等.甜菊糖的应用现状及发展前景[J].发酵科技通讯,2011,40(1):40-44.[2]倪军明,李军平.甜菊糖工业发展现状与前景[J].现代食品科技,2004,20(3):156-158.[3]唐志发.甜菊糖的崛起与发展战略[J].中国食品工业,1999,2:52-55.[4]KOVYLYAEVAGI,BAKALEINIKGA,STROBYKINAIY,etal.GlycosidesfromSteviarebaudiana[J].ChemistryofNaturalCompounds,2007,43(1):81-85.[5]KINGHORNAD,KINGHORNAD.Stevia:thegenusStevia[J].CrcPress,2002.[6]OLSSONK,CARLSENS,SEMMLERA,etal.Microbialproductionofnext-generationsteviasweeteners[J].MicrobCellFact,2016,15(1):207-220.[7]UPRETIM,DUBOISG,PRAKASHI.Syntheticstudyontherelationshipbetweenstructureandsweettastepropertiesofsteviolglycosides[J].Molecules,2012,17(4):4186-4196.
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前制备莱鲍迪苷M经济效率低下的问题，提供一种生物催化合成莱鲍迪苷M的新路线，首先利用糖基转移酶UGTSL2糖基化作用，催化甜菊甙合成莱鲍迪苷E，随后利用糖基转移酶UGT76G1催化莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷M，为莱鲍迪苷M的制备及精制提供有力基础。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的大肠杆菌基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，无需添加UDP-葡萄糖和UDP，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖，建立循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。所述自诱导发酵中诱导剂为乳糖，乳糖在发酵培养液中浓度为0.01~0.5%。该方法具体分为两步进行，如图2所示，（1）首先，原料甜菊甙经UDP-糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1双酶催化生成中间产物莱鲍迪苷E；（2）中间产物莱鲍迪苷E经UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1双酶催化生成最终产物莱鲍迪苷M。所述UDP-糖基转移酶UGT-A为番茄来源糖基转移酶UGTSL2，为NCBIReferenceSequence:NC_015448.3，基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列（Uniprotnumber:K4D508）见SEQ.No.4所示；所述UDP-糖基转移酶UGT-B为甜叶菊来源糖基转移酶UGT76G1，为NCBIReferenceSequence:AY345974.1，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列（Uniprotnumber:Q6VAB4）见SEQ.No.5所示；所述蔗糖合成酶SUS为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，为NCBIReferenceSequence:M18745，基因序列见SEQ.No.3所示，氨基酸序列（Uniprotnumber:P10691）见SEQ.No.6所示。步骤1中的基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1共表达载体的重组大肠杆菌，UGTSL2基因片段插入在质粒载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体的NcoI和EcoRI酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGTSL2和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGTSL2-StSUS1。步骤2中的基因工程菌为含有UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1共表达载体的重组大肠杆菌，UGT76G1基因片段插入在质粒载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，StSUS1基因片段插入在质粒载体的NcoI和EcoRI酶切位点之间，最终提供了可外源共表达糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶StSUS1的重组质粒，pRSFDuet-UGT76G1-StSUS1；将重组质粒热击转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，转化产物涂布于含有50mg/L的卡那霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，获得共表达的重组大肠杆菌基因工程菌。步骤1）和步骤2）构建得到的重组大肠杆菌基因工程菌诱导表达条件为：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中，于16~37℃、200rpm振荡培养8~10h，再将培养菌液按2%接种量接入TB培养基中，其中诱导剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP‑糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。

【技术特征摘要】
1.一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，利用分子克隆技术，获得异源表达UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的基因工程菌，经自诱导发酵产酶后以细胞粗提液直接进行催化反应，利用粗提液中本身含有的微量UDP及额外添加的蔗糖，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M。2.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，催化甜菊甙生产莱鲍迪苷M包括如下两步骤：（1）UDP-糖基转移酶UGT-A和蔗糖合成酶SUS共表达双酶催化甜菊甙合成中间产物莱鲍迪苷E；（2）UDP-糖基转移酶UGT-B和蔗糖合成酶SUS共表达双酶催化莱鲍迪苷E合成最终产物莱鲍迪苷M。3.根据权利要求2所述一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述UDP-糖基转移酶UGT-A为番茄来源糖基转移酶UGTSL2，基因序列见SEQ.No.1所示，氨基酸序列见SEQ.No.4所示；所述UDP-糖基转移酶UGT-B为甜叶菊来源糖基转移酶UGT76G1，基因序列见SEQ.No.2所示，氨基酸序列见SEQ.No.5所示；所述蔗糖合成酶SUS为马铃薯来源蔗糖合成酶StSUS1，基因序列见SEQ.No.3所示，氨基酸序列见SEQ.No.6所示。4.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于，所述细胞粗提液为发酵得到的菌体经超声或低温高压破碎所获得的含有UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶的粗酶液。5.根据权利要求1所述的一种生物催化合成莱鲍迪苷M的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾红华，李艳，陈量量，潘华祎，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32