一种间充质干细胞无血清培养方法技术

本发明专利技术公开了一种间充质干细胞无血清大规模培养方法。相比现有技术中使用血清的培养体系，本发明专利技术采用无血清培养基和血清替代物，通过转瓶培养工艺来大规模培养间充质干细胞，从而整个培养体系没有引入动物源成分，滚瓶工艺也节约了人力和物力，使得不仅能够较快地扩增出大量间充质干细胞，而且在本发明专利技术整个传代培养过程中间充质干细胞生长状态良好、培养工艺稳定，扩增所得到的间充质干细胞保持了较高的活率，具有良好的临床应用前景。

A Serum-free Culture Method for Mesenchymal Stem Cells

The invention discloses a serum-free large-scale culture method of mesenchymal stem cells. Compared with the culture system using serum in the prior art, the present invention adopts serum-free culture medium and serum substitutes to cultivate mesenchymal stem cells on a large scale by rotating flask culture technology, so that the whole culture system does not introduce animal-derived ingredients, and the flask rolling technology also saves human and material resources, so that not only a large number of mesenchymal stem cells can be rapidly expanded, but also the invention is complete. Mesenchymal stem cells (MSCs) grew well and cultured steadily during the course of passage culture. The MSCs obtained by amplification maintained a high survival rate and had a good prospect for clinical application.

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞无血清培养方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种间充质干细胞无血清大规模培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSC)是一类来源于发育早期中胚层及外胚层的多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞在临床上可应用于解决多种血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，此外还在神经系统修复等方面具有发展前景。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞，但存在以下问题：随着年龄的老化，骨髓间充质干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；其制备过程不容易质控；移植给异体时可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。研究表明，脐带来源的间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志物，并具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低的特性；另外其取材方便，无道德伦理问题的限制，更易于工业化制备。因此，脐带间充质干细胞不仅能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。因此通过间充质干细胞的大规模培养来进行高效扩增，以便为广泛的临床和科研应用提供充足的间充质干细胞细胞数量储备，是当前受到关注的应用课题。目前，最常见的间充质干细胞培养体系是采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行体外培养与扩增。虽然FBS可为间充质干细胞提供必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。综上所述，人们亟待获得有效地扩增更多具有较高活性的间充质干细胞的方法。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的扩增间充质干细胞的方法的缺点，本专利技术的目的在于提供一种高效的间充质干细胞无血清大规模培养方法，其包括以下步骤：1)将间充质干细胞(首次扩增培养使用制备的原代间充质干细胞，即P0代)测定细胞的总数和活率后，吸取所述细胞接种到细胞培养容器中，接种密度5x103-6x103个/cm2，并加入由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后将所述细胞培养容器放入细胞培养转动装置中，并调整转速；2)在所述细胞培养转动装置上培养至细胞汇合度达80％-90％时，倒掉所述细胞培养容器中的培养基，使用生理盐水洗涤，然后加入蛋白酶充分消化细胞；3)待细胞伪足完全回缩、细胞变圆后，加入所述完全培养基以终止消化；然后吹打以得到间充质干细胞悬液，收集于离心管中进行离心沉淀，弃上清后再加入新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，对扩增后的新一代(由P0代扩增得到的即为P1代，依次连续传代则逐渐递增为P2代、P3代，等等)间充质干细胞取样测定细胞的总数和活率；4)使用上述扩增后的新一代间充质干细胞重复步骤1)至3)进行传代培养，并视情况而定多次传代以进行大规模扩增。在本专利技术一些实施方案中，所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。在本专利技术一些实施方案中，所述细胞培养容器为转瓶，且细胞培养转动装置为CO2滚瓶机，在步骤1)中吸取1.0×107-1.5×107个所述细胞接种到1900cm2表面积的细胞培养转瓶中，并加入300-500mL所述完全培养基，再将所述转瓶放入CO2滚瓶机中，并调整转速为10-30rpm。在本专利技术上述实施方案中，所述基础培养基为α-MEM基础培养基如Corning、Hyclone或BI牌的产品，且所述血清替代物为GMP级的血清替代物如Helios或PALL牌的产品。在本专利技术上述实施方案中，所述细胞培养容器为转瓶，且细胞培养转动装置为CO2滚瓶机，在步骤2)中在所述滚瓶机上培养3-5天，当细胞汇合度达80％-90％时，倒掉转瓶中的培养基，使用生理盐水洗涤2-3次，然后加入蛋白酶消化细胞。进一步地，在步骤2)中在所述滚瓶机上培养至细胞汇合度达85％-90％时，倒掉转瓶中的培养基，使用生理盐水洗涤2次，然后加入TrypLETM蛋白酶消化细胞3-5min。在本专利技术上述实施方案中，在步骤3)中加入20-50mL所述完全培养基以终止消化；然后吹打以得到间充质干细胞悬液，收集于50mL离心管中在1300-1600rpm下离心4-8min，弃上清后再加入40mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀。进一步地，在步骤3)中所述细胞被终止消化后，收集于所述离心管中的间充质干细胞悬液在1500rpm下离心5min。在本专利技术上述实施方案中，在步骤4)中视情况而定进行6-18次传代以进行大规模扩增。有益效果相比现有技术中使用血清的培养体系，本专利技术的间充质干细胞无血清大规模培养方法采用无血清培养基和血清替代物，通过转瓶培养工艺来大规模培养间充质干细胞，整个培养体系避免了引入动物源成分，滚瓶工艺也节约了人力和物力，使得不经能够较快地扩增出大量间充质干细胞，而且在本专利技术整个传代培养过程中，间充质干细胞生长状态良好、培养工艺稳定，扩增所得到的间充质干细胞保持了较高的活率，具有良好的临床应用前景。附图说明图1为实施例3中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞数量的生长曲线图。图2为实施例3中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的细胞活率图。图3为实施例4中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞数量的生长曲线图。图4为实施例4中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的细胞活率图。图5为实施例5中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞数量的生长曲线图。图6为实施例5中依次扩增的P1-P8各代次间充质干细胞的细胞活率图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例实施例1：脐带组织小块的获取1)将处理好的足月剖腹产健康新生儿脐带，去除脐带的结扎两端，并用眼科剪将该长10-15cm的中间段剪成2-3cm长的脐带组织段，用含1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)的生理盐水反复漂洗所述脐带组织段以去除血迹。2)剖开上述脐带组织段，并去除动脉和静脉血管(2条动脉和1条静脉)及表皮组织，获得脐带华通氏胶组织段，用含1％双抗的生理盐水反复漂洗后，将其剪碎成约3mm×3mm×1mm的华通氏胶组织块。实施例2：华通氏胶组织块的贴壁培养与原代间充质干细胞的获取1)按照1块/cm2将实施例1的华通氏胶组织块接种至直径10cm细胞培养皿中平铺贴壁，每个培养皿中加入约30-50块所述组织块，适当风干组织块以使其减少水分、贴壁牢固。2)向每个培养皿中轻轻加入5mL由基础培养基(α-MEMCornig)和血清替代物(HeliosGMP级)组成的完全培养基(其中含有3％体积比的血清替代物)，不要将组织块吹起，随后放入37℃、5％CO2的培养箱中孵育培养；培养5天后更换新鲜完全培养基5mL，继续静置培养5-9天，期间每隔3-4天更换新的完全培养基；3)观察到大量从华通氏胶组织块中爬出的间充质干细胞后，倒掉培养基并使用生理盐水洗2次，然后使用TrypLETM(美国赛默飞世尔科技公司的Gibco牌产品)对爬出的间充质干细胞进行充分消化约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞无血清培养方法，其特征在于，包含如下步骤：1)将间充质干细胞测定细胞的总数和活率后，吸取所述细胞接种到细胞培养容器中，接种密度5x10

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞无血清培养方法，其特征在于，包含如下步骤：1)将间充质干细胞测定细胞的总数和活率后，吸取所述细胞接种到细胞培养容器中，接种密度5x103-6x103个/cm2，并加入由基础培养基和血清替代物组成的完全培养基，其中所述完全培养基中含有3-5％体积比的血清替代物，然后将所述细胞培养容器放入细胞培养转动装置中，并调整转速；2)在所述细胞培养转动装置上培养至细胞汇合度达80％-90％时，倒掉所述细胞培养容器中的培养基，使用生理盐水洗涤，然后加入蛋白酶充分消化细胞；3)待细胞伪足完全回缩、细胞变圆后，加入所述完全培养基以终止消化；然后吹打以得到间充质干细胞悬液，收集于离心管中进行离心沉淀，弃上清后再加入新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，对扩增后的新一代间充质干细胞取样测定细胞的总数和活率；4)使用上述扩增后的新一代间充质干细胞重复步骤1)至3)进行传代培养，并视情况而定多次传代以进行大规模扩增。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为从人源脐带组织获取的间充质干细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养容器为转瓶，且细胞培养转动装置为CO2滚瓶机，在步骤1)中吸取1.0×107-1.5×107个所述细胞接种到1900cm2表面积的细胞培养转瓶中，并加入300-500mL所述完全培养基，再将所述转瓶放入CO2滚瓶机中，并调...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵进军，谷广其，杨桂花，赵宇飞，李张鹏，
申请(专利权)人：和携科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11