一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法技术

本发明专利技术涉及化工技术领域，尤其是一种3‑羟基丙酸产生菌株的筛选方法，包括1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中,37℃摇床振荡培养，再180 r/min培养24 h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1‑2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL,再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株。本发明专利技术通过多种筛选碳源的测试，得出3‑羟基丙酸产生菌株的筛选方法，且反应体系简单，成本较低，可有助于相关研究工作的开展，具有十分重要的应用价值。

Screening of a 3-hydroxypropionic acid producing strain

The invention relates to the technical field of chemical industry, in particular to a screening method for 3 -hydroxypropionic acid producing strains, including 1) enriched soil bacteria: 5 1 g soil samples were cultured in 5 250 mL triangular flasks containing 100 mL enrichment medium, shaking bed at 37 C, and then cultured in 180 r/min for 24 h; 5 ml enrichment medium was transferred to various carbon source utilization medium, 250 mL triangular flask liquid was used. Quantity 100 mL, shaking bed 180 r/min at 37 (?) for 1_2 days; treatment of culture medium: take 5 ml of culture medium from step 1, centrifuge the supernatant for 5 minutes with 2000 r/min, and then treat the finished sample with strong acid 732 cation exchange resin. 3) Detection of target strains: first use the method of HPLC and then use paper chromatography to detect whether there are target strains in the sample. The invention obtains a screening method for 3 -hydroxypropionic acid producing strains by testing various screening carbon sources, and the reaction system is simple and the cost is low, which can help the development of related research work and has very important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法
本专利技术涉及化工
，尤其涉及一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法。
技术介绍
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionicacid，简写3-HP)是一种具有三个碳原子的非手性有机酸，酸解离常数(pKa)为4.5，呈液态，具有黏性，无色无味，可溶于水、乙醇、乙醚。3-羟基丙酸在分子两端分别带有1个羧基和1个羟基,是比它的同分异构体乳酸更为活泼的分子,在工业上被用来合成很多重要的化工产品,如氢化成为1，3丙二醇,氧化为丙二酸,脱水得到丙烯酸,及聚合为高分子材料等,是一种重要的化工平台产品。目前，市场上的3-HP均以不可再生的石化资源为原料采用化学合成法生产，难度较大，且产品分离纯化较复杂，生产成本高。国内外进行了在自然界中微量目标代谢产物及相关菌种的检出方法的探索，因此本实验提出的一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中产品分离纯化较复杂，生产成本高的缺点，而提出的一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：设计一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中,37℃摇床振荡培养，再180r/min培养24h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1-2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL,再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株；4）、菌株的纯化：将步骤3）中检测出的样品得到的菌落放置在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进行分离和纯化；此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于30-38℃,150r/min震荡条件下,遮光培养36-48h,得到单菌落培养液；5）、目标菌株的提取：将含有目标菌株的培养液粗品溶液与有机溶剂充分混合，通过蒸馏的方法得到含有3-羟基丙酸的有机相或纯化的3-羟基丙酸即可。优选的，所述步骤1）中的土样在采样时先去除5cm表土，采集5-15cm深的土壤。优选的，所述富集培养基是由胰蛋白胨1.7,大豆胨0.3，葡萄糖2.5,Na0H5，K2HP042.5，水100，pH7.1-7.5，115℃蒸汽灰菌20min制成。优选的，所述碳源利用培养基是由酪蛋白胨0.5，葡萄糖0.25，NaC10.5，K2HP040.25，碳源1.5，水100，pH7.5，115℃蒸汽灭菌20min制成。优选的，所述步骤1）中的碳源包括葡萄糖、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、木糖。优选的，所述步骤4）中的震荡加入的碱性催化剂由在水中能电离出氢氧根的均相和多相碱性物质组成。优选的，所述碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钙、有机胺、氢氧化镁、镁铝水滑石、碱性分子筛、氧化铝中的一种或多种。优选的，所述步骤1）中的有机溶剂是由酯类、酮类、醇类、磷酸酯类、磷氧类、膦硫类、胺类、及其他有机化合物中的一种或多种组成，且所述有机化合物的沸点在常压下均大于100℃。本专利技术提出的一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，有益效果在于：本专利技术通过多种筛选碳源的测试，得出3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，且反应体系简单，成本较低，可有助于相关研究工作的开展，易于工业化，具有十分重要的应用价值。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中,37℃摇床振荡培养，再180r/min培养24h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1-2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL,再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株；4）、菌株的纯化：将步骤3）中检测出的样品得到的菌落放置在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进行分离和纯化；此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于30℃,150r/min震荡条件下,遮光培养36h,得到单菌落培养液；5）、目标菌株的提取：将含有目标菌株的培养液粗品溶液与有机溶剂充分混合，通过蒸馏的方法得到含有3-羟基丙酸的有机相或纯化的3-羟基丙酸即可。其中，步骤1）中的土样在采样时先去除5cm表土，采集5-15cm深的土壤。其中，富集培养基是由胰蛋白胨1.7,大豆胨0.3，葡萄糖2.5,Na0H5，K2HP042.5，水100，pH7.1-7.5，115℃蒸汽灰菌20min制成。其中，碳源利用培养基是由酪蛋白胨0.5，葡萄糖0.25，NaC10.5，K2HP040.25，碳源1.5，水100，pH7.5，115℃蒸汽灭菌20min制成。其中，步骤1）中的碳源包括葡萄糖、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、甘油、木糖。其中，步骤4）中的震荡加入的碱性催化剂由在水中能电离出氢氧根的均相和多相碱性物质组成。其中，碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钙、有机胺、氢氧化镁、镁铝水滑石、碱性分子筛、氧化铝中的一种或多种。其中，步骤1）中的有机溶剂是由酯类、酮类、醇类、磷酸酯类、磷氧类、膦硫类、胺类、及其他有机化合物中的一种或多种组成，且所述有机化合物的沸点在常压下均大于100℃。实施例2一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中,37℃摇床振荡培养，再180r/min培养24h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1-2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL,再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株；4）、菌株的纯化：将步骤3）中检测出的样品得到的菌落放置在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进行分离和纯化；此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于35℃,150r/min震荡条件下,遮光培养42h,得到单菌落培养液；5）、目标菌株的提取：将含有目标菌株的培养液粗品溶液与有机溶剂充分混合，通过蒸馏的方法得到含有3-羟基丙酸的有机相或纯化的3-羟基丙酸即可。实施例3一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3‑羟基丙酸产生菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中, 37℃摇床振荡培养，再180 r/min培养24 h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1‑2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL, 再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株；4）、菌株的纯化：将步骤3）中检测出的样品得到的菌落放置在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进行分离和纯化；此步骤重复2‑3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于30‑38℃,150r/min震荡条件下,遮光培养36‑48h,得到单菌落培养液；5）、目标菌株的提取：将含有目标菌株的培养液粗品溶液与有机溶剂充分混合，通过蒸馏的方法得到含有3‑羟基丙酸的有机相或纯化的3‑羟基丙酸即可。...

【技术特征摘要】
1.一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1）、富集土壤菌种：取5份1g土样于5个装有100mL富集培养基的250mL的三角瓶中,37℃摇床振荡培养，再180r/min培养24h；再分别取5mL富集培养液转接到各项碳源利用培养基中，250mL三角瓶装液量100mL,37℃摇床180r/min振荡培养1-2d；2）、培养液的处理：取步骤1）中培养完成的培养液5mL,再以2000r/min离心5min取上清液,用强酸型732阳离子交换树脂进行处理,处理完成的样品待测；3）、检测目标菌株：先采用HPLC分析法再使用纸层析法检测样品中是否有目标菌株；4）、菌株的纯化：将步骤3）中检测出的样品得到的菌落放置在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进行分离和纯化；此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中,置于30-38℃,150r/min震荡条件下,遮光培养36-48h,得到单菌落培养液；5）、目标菌株的提取：将含有目标菌株的培养液粗品溶液与有机溶剂充分混合，通过蒸馏的方法得到含有3-羟基丙酸的有机相或纯化的3-羟基丙酸即可。2.根据权利要求1所述的一种3-羟基丙酸产生菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤1）中的土样在采样时先去除5cm表土，采集5-15cm深的土壤。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王陶，李文，杨英歌，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32