一种视网膜色素变性筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种突变基因，其特征在于：它是在人类CRB1基因的基础上出现c.1997 T＞A和/或c.2426 A＞C突变。本发明专利技术还提供了检测人类CRB1基因突变位点c.1997 T＞A和/或c.2426 A＞C的相关试剂在制备视网膜色素变性的筛查试剂中的用途。本发明专利技术将CRB1基因c.1997 T＞A和/或c.2426 A＞C位点的变异，应用于视网膜色素变性辅助诊断试剂盒的制备中，能达到筛查的目的。

A Kit for Screening Retinopathy

The invention provides a mutant gene, which is characterized by the occurrence of c.1997 T>A and/or c.2426 A>C mutations on the basis of human CRB1 gene. The present invention also provides the application of related reagents for detecting human CRB1 gene mutation sites c.1997 T>A and/or c.2426 A>C in preparing screening reagents for retinitis pigmentosa. The invention applies the mutation of CRB1 gene c.1997 T>A and/or c.2426 A>C locus to the preparation of assistant diagnostic kit for retinitis pigmentosa, and achieves the purpose of screening.

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜色素变性筛查试剂盒
本专利技术涉及基因点突变领域，特别涉及与视网膜色素变性相关的点突变。
技术介绍
视网膜色素变性(RP)是一种进行性、遗传性、营养不良性退行性病变，主要表现为慢性进行性视野缺失，夜盲，色素性视网膜病变和视网膜电图异常，最终可导致视力下降甚至失明。RP的遗传方式有常染色体隐性、显性与X性连锁隐性三种，其中以常染色体隐性遗传最多。做好产前诊断对预防常染色体隐性遗传的RP具有重大意义。而目前已知的RP致病相关的突变位点尚不完整，依据已知突变位点开发的试剂盒可能导致RP的漏诊。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供新的RP致病相关突变位点，以及它们在制备视网膜色素变性筛查试剂盒中的用途。首先，本专利技术提供了一种突变基因，其特征在于：它是在人类CRB1基因的基础上出现以下突变得到：c.1997T＞A和/或c.2426A＞C：编码区第1997位碱基T突变成A；和/或，c.2426A＞C：编码区第2426位碱基A突变成C。本专利技术还提供了检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂在制备视网膜色素变性的筛查试剂中的用途。如前述的用途，所述的试剂包括检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类CRB1基因编码区第1997和/或2426位碱基的核酸片段的相关试剂。如前述的用途，所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为测序试剂。如前述的用途，所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。本专利技术还提供了一种视网膜色素变性的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂。如前述的试剂盒，所述的试剂包括检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类CRB1基因编码区第1997和/或2426位碱基的核酸片段的相关试剂。如前述的试剂盒，所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为测序试剂。如前述的试剂盒，所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为测序用试剂或荧光定量PCR试剂。如前述的试剂盒，所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。本专利技术的试剂盒，通过检测CRB1基因的突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C来辅助视网膜色素变性的筛查，具有可靠的特异性。本专利技术的试剂盒在正常人中未能检测到所述突变，而在所检测的视网膜色素变性家系的确诊患病成员中，都检测出所述突变，检测结果具有可重复性。本专利技术所提供的检测CRB1基因的突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的试剂在制备视网膜色素变性筛查试剂盒的用途。且该检测试剂可以是包括测序用试剂、荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂、单链构象多态性分析用试剂或者测序试剂等多种SNP检测试剂，转化生产的前景十分广阔。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例、实验例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1是视网膜色素变性家系图：实心方形或圆形表示视网膜色素变性患者；箭头表示先证者；斜杠表示已故。图2是本专利技术所述突变位点c.2426A＞C的测序图。图3是本专利技术所述突变位点c.1997T＞A的测序图。具体实施方式实施例本专利技术的试剂盒及使用方法本专利技术试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：1.PCR扩增试剂(50人份)：PCR扩增试剂用于扩增突变位点所在的一段DNA序列，其组成见表1。表1PCR扩增试剂组分浓度体积PCR混合液2×600μl引物对10μM100μl纯水2ml表1中PCR混合液包括Taq酶、dNTP、镁离子等常规PCR所需成分；其中引物对信息如表2所示。表2CRB1基因扩增所用引物2.CRB1基因变异分型检测试剂(50人份)：该试剂包括如表3所示的组分。表3CRB1基因变异分型检测试剂组分体积血清碱性磷酸酶100μl限制性外切酶6μl纯化缓冲液6μlBigdyeMix15μl5×buffer120μlddH2O1mlF引物各50μl所述F引物为测序用引物，具体序列如下：c.1997T＞A测序引物(SEQIDNO.1)：AGTGGCATTTCGTGGAGGTA；c.2426A＞C测序引物(SEQIDNO.3)：TTTGTCCGAACGCTTCAACC。3.标准DNA样品：带有CRB1基因c.1997T＞A和/或c.2426A＞C位点的野生纯合子/杂合子DNA，各50μl。4.使用方法：1)DNA提取取患者全血(EDTA抗凝)2ml，提取其基因组DNA。2)通过PCR扩增含有所检测的突变位点的DNA片段，每个突变位点PCR扩增体系如下：组分浓度体积样品DNA50ng/μl及以上1μlPCR试剂混合液2×10μl引物对10μM2μl纯水7μl反应条件(具体退火温度见表2)：PCR产物检测：用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在后续反应中加入的量。3)Sanger测序检测第一步：PCR产物纯化体系：组分体积PCR产物4μl血清碱性磷酸酶2μl限制性外切酶0.1μl纯化缓冲液0.1μl反应条件：第二步：Sanger测序将前述分型检测试剂作为测序扩增试剂，用于第一步纯化的PCR产物的Sanger测序。如果测序结果在编码区第1997位碱基T突变成A、和/或编码区第2426位碱基A突变成C，则说明该检测样本视网膜色素变性患有视网膜色素变性。为了进一步说明本专利技术所述突变位点与视网膜色素变性的关系，以及本专利技术试剂盒的效果，提供以下实验例。实验例突变位点的验证1.方法1.1眼科检查和外显子测序招募2个视网膜色素变性(RP)家系(编号为RP-2284和RP-2360)，对所有的RP成员都进行了完整的眼科检查，确认其具有视网膜色素变性。在RP-2284家系中有2名RP患者，在RP-2360家系中有1名RP患者。1.2测序验证再扩增RP家系所有成员以及1260名健康人(作为对照)的CRB1基因，进行Sanger测序，验证CRB1的c.1997T＞A和c.2426A＞C位点是否与RP直接相关。1.3Polyohen-2软件预测使用Polyohen-2软件对前述位点进行分析，预测其突变是否会对蛋白的功能造成影响。2.结果测序结果显示，家系RP-2284和RP-2360的患病成员依次携带c.1997T＞A和c.2426A＞C纯合突变；而家系中患者父母均携带患者对应位点的杂合突变，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变基因，其特征在于：它是在人类CRB1基因的基础上出现以下突变得到：c.1997T＞A：编码区第1997位碱基T突变成A；和/或，c.2426A＞C：编码区第2426位碱基A突变成C。

【技术特征摘要】
1.一种突变基因，其特征在于：它是在人类CRB1基因的基础上出现以下突变得到：c.1997T＞A：编码区第1997位碱基T突变成A；和/或，c.2426A＞C：编码区第2426位碱基A突变成C。2.检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂在制备视网膜色素变性的筛查试剂中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的试剂包括检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂；还包括任选的用于扩增包含人类CRB1基因编码区第1997和/或2426位碱基的核酸片段的相关试剂。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为测序试剂。5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测人类CRB1基因突变位点c.1997T＞A和/或c.2426A＞C的相关试剂为荧光定量PCR试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚波，郭小新，曲超，
申请(专利权)人：四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川,51