一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法技术

本发明专利技术提供了一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法，属于基因工程技术领域。一种EP153R基因与P54基因过表达腺病毒载体，以pShuttle‑CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因。本发明专利技术还提供了共表达EP153R、P54基因的重组腺病毒，利用构建得到的pAD‑Shuttle‑CMV‑CTLA4‑EP153R‑P54载体实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染动物或真核细胞的腺病毒，从而实现了EP153R与P54基因在真核细胞中共表达的目的，为研究实现EP153R与P54基因共表达的腺病毒疫苗奠定了基础。

Construction of recombinant adenovirus vector co-expressing EP153R and P54 gene of African classical swine fever and packaging method of adenovirus

The invention provides a method for constructing recombinant adenovirus vector co-expressing African classical swine fever EP153R and P54 gene and packaging adenovirus, belonging to the field of genetic engineering technology. An adenovirus vector with over-expression of EP153R gene and P54 gene was introduced into CTLA4, EP153R and P54 gene at polyclonal sites on the basis of pShuttle_CMV eukaryotic expression vector. The present invention also provides recombinant adenoviruses co-expressing EP153R and P54 genes, realizes the packaging process of adenoviruses by using the constructed pAD Shuttle CMV CTLA4 EP153R P54 vector, and obtains adenoviruses that can directly infect animals or eukaryotic cells, thus realizes the co-expression of EP153R and P54 genes in eukaryotic cells, and studies the co-expression of EP153R and P54 genes in eukaryotic cells. Viral vaccines laid the foundation.

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉一种非洲猪瘟病毒CTLA4、EP153R、P54基因共表达重组腺病毒载体、构建方法及腺病毒包装方法。
技术介绍
非洲猪瘟(africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短、病死率高、临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体病毒，病毒含有直径70～100nmDNA核心，外周是直径172～191nm二十面体的衣壳和含类脂的囊膜。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170～190kb(随毒株的不同而有差异)，末端交互连接，有末端倒置重复序列。基因组可以编码150～200种蛋白质，编码这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。CTLA4(cytotoxicT-lymphocyteassociatedprotein4)基因(NC_010457.5)即细胞毒性T细胞相关抗原-4：属于免疫球蛋白超家族,主要在活化的CD4+和CD8+T细胞以及激活的B细胞表面表达。CTLA-4可与CD28分子竞争结合T细胞上的B7分子,且其亲合力是CD28的10～50倍,因此是免疫应答负调节的主要表面吸附分子，可作为抗原递呈细胞的靶向分子，诱导强烈的体液和细胞免疫。EP153R基因(GI：22220439)全长474bp，编码产生158个碱基组成的跨膜蛋白，与CD44分子的N端区域有显著的同源性，包含N-糖基化位点、磷酸化作用位点、酰化作用位点、中央跨膜区、c型动物凝集结构域、细胞附着序列。EP153R基因主要在病毒感染的早期与晚期，据报道，EP153R基因可诱导或保持病毒CD2同源物与其相应受体的结合；EP153R基因的C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用；EP153R基因的存在使病毒感染或星形孢菌素处理Vero细胞中P53蛋白的转录活性降低，这是第一个描述具有抗凋亡特性的c型动物凝集素。构建表达EP153R基因的重组腺病毒载体能够更好的研究基因功能，为研发非洲猪瘟候选疫苗提供技术支持。P54蛋白是ASFV的Ⅰ型跨膜结构蛋白，由E183L(GI:290782550)基因编码，在病毒的复制过程中起重要作用，参与该病毒对细胞的吸附和侵入，能引起宿主细胞凋亡，在病毒变形和感染早期起重要作用。P54蛋白可生成二硫键，在ASFV转染细胞时，形成包膜前体，通过靶向定位内质网膜进行蛋白表达，损伤细胞，P54抗体可中和P54蛋白，部分阻断ASFV的侵入，减轻宿主细胞的损伤。而目前，现有技术中没有CTLA4、EP153R、P54基因共表达的重组腺病毒载体。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒、构建方法及腺病毒包装方法，为研究非洲猪瘟抗体奠定技术基础。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54，以pShuttle-CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因；所述CTLA4基因具有如序列表中SeqIDNo.1所示的核苷酸序列，所述EP153R基因具有如序列表中SeqIDNo.2所示的核苷酸序列，所述P54基因具有如序列表中SeqIDNo.3所示的核苷酸序列。所述多克隆位点为KpnI、HindIII的酶切位点。本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：1)查询NCBI网站收录的EP153R基因(GI：22220439)、P54基因(GI:290782550)，通过人工合成，获取优化后的基因片段，并分别在EP153R基因、P54基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区；CTLA4基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区，CTLA4模板为猪细胞系；2)用限制性内切酶KpnI和HindIII对pShuttle-CMV载体进行双酶切，得到线性化pShuttle-CMV载体；3)将所述步骤2)得到的线性化pShuttle-CMV载体与CTLA4-EP153R、P54进行同源重组，得到pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒，使用CMV-F与SV40-R进行测序；4)将所述步骤3)得到的pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒进行瞬时表达，标签蛋白验证蛋白表达；5)将所述步骤3)得到的pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒进行PmeI酶切，转化入BJ5183大肠杆菌进行重组，得到共表达腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54。本专利技术还提供一种重组腺病毒包装方法，将pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54共表达腺病毒载体用PacI进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293A细胞，实现重组腺病毒包装。具体由以下步骤制备得到：1)将pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒用PacI进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；使用Lip3000转染试剂转染293A细胞；2)转染后至细胞脱落较多，收集细胞及上清，即为P1代腺病毒；3)P1代腺病毒感染293A细胞，观察细胞状态。本专利技术还涉及前述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒，以及包含前述的重组腺病毒的疫苗。本专利技术提供了一种EP153R基因过表达腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54，以pShuttle-CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因。该载体携带CMV强启动子，能在真核细胞中过表达其携带的基因，同时CTLA4可增强免疫应答，经筛选，最终得到能够直接感染真核细胞的腺病毒，从而实现了EP153R、P54基因在真核细胞中共表达的目的，为进一步研究基于共表达EP153R、P54基因重组腺病毒载体疫苗打好基础。附图说明图1为实施例3中pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54质粒酶切验证图；1：1号质粒SalI+XhoI；2：2号质粒SalI+XhoI；M1：DL2000DNAMarker；M2：1KBDNAMarker；图2为实施例4中pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54质粒瞬转24hHA标签蛋白WB验证图；1：pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54质粒；2：pShuttle-EGFP-CTLA4-EP153R-P54质粒；3：293T空白对照；M：蛋白Marker；图3为实施例5中pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54PacI酶切验证图；1：1号质粒；2：2号质粒；M1：λ-HindⅢdigest；M2：1kbDNAMarker；图4为实施例7中ADV感染细胞48hH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体，其特征在于，以pShuttle‑CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因以构建重组腺病毒载体pAD‑Shuttle‑CMV‑CTLA4‑EP153R‑P54；所述CTLA4基因、EP153R基因、P54基因分别具有如序列表中Seq ID No.1、Seq ID No.2 、Seq ID No.3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体，其特征在于，以pShuttle-CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因以构建重组腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54；所述CTLA4基因、EP153R基因、P54基因分别具有如序列表中SeqIDNo.1、SeqIDNo.2、SeqIDNo.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体，其特征在于，所述多克隆位点为KpnI和HindIII的酶切位点。3.一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：1)针对EP153R基因、P54基因，通过人工合成，获取优化后的基因片段，并分别在EP153R基因、P54基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区；CTLA4基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区；2）用限制性内切酶KpnI和HindIII对pShuttle-CMV载体进行双酶切，得到线性化pShuttle-CMV载体；3）将所述步骤2）得到的线性化pShuttle-CMV载体与CTLA4-EP153R、P54进行同源重组，得到pShuttle-CMV-CTLA4-EP1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泉，黄明生，谢灵志，朱立麒，殷俊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32