SH2D1A基因、sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了SH2D1A基因及其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物或制备抗肿瘤药物中的应用，涉及T细胞分子生物领域；本发明专利技术通过在不同耗竭程度的CD8+T细胞中表达差异最显著的基因的发现、检测及其应用，通过高通量RNA测序，发现SH2D1A在CD8+T细胞耗竭发生发展中具有重要调节作用，SH2D1A表达与CD8+T细胞耗竭的发生、发展密切相关；再根据SH2D1A的编码序列，设计合成sgRNA，通过与质粒载体结合，转化，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在CD8+T细胞中敲低SH2D1A，能够显著减少CD8+T细胞耗竭的发生，显著恢复耗竭的CD8+T细胞的抗肿瘤能力，可应用于制备抗肿瘤药物。

SH2D1A Gene, sgRNA and Its Application

The invention discloses the application of SH2D1A gene and its sgRNA in the preparation of drugs for restoring T cell depletion or preparing anti-cancer drugs, which relates to the field of T cell molecular biology; The invention discovers, detects and applies genes with the most significant difference in expression in CD8+T cells with different depletion degrees, and finds that SH2D1A has a heavy role in the occurrence and development of CD8+T cell depletion through high-throughput RNA sequencing. The expression of SH2D1A is closely related to the occurrence and development of CD8+T cell depletion. Then, according to the coding sequence of SH2D1A, sgRNA is designed and synthesized. By combining with plasmid vector, transforming and knocking down SH2D1A in CD8+T cells by CRISPR/Cas9 gene editing technology, the occurrence of CD8+T cell depletion can be significantly reduced, and the anti-tumor ability of exhausted CD8+T cells can be significantly restored. It is used to prepare antineoplastic drugs.

【技术实现步骤摘要】
SH2D1A基因、sgRNA及其应用
本专利技术属于T细胞分子生物领域，具体而言，本专利技术具体涉及SH2D1A基因及其sgRNA及其应用。
技术介绍
原发性肝癌，是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居于全球恶性肿瘤第五位，致死率列第三位，按病理学分型可分为肝细胞型、胆管细胞型和混合型三种，其中以肝细胞肝癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)最为常见，占原发性肝癌90％以上(ChenW,etal.CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin2016；66:115-132.)。导致HCC的主要病因为慢性活动性肝炎，包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)导致的病毒性肝炎，酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝性肝炎。目前国内常见的肝细胞肝癌以HBV感染为主要途径。HCC以早期症状隐匿，复发率高及预后不佳为主要特点(LlovetJM,etal.Advancesintargetedtherapiesforhepatocellularcarcinomainthegenomicera.NatRevClinOncol2015；12:408-424；MiltiadousO,etal.ProgenitorcellmarkerspredictoutcomeofpatientswithhepatocellularcarcinomabeyondMilancriteriaundergoinglivertransplantation.JHepatol2015；63:1368-1377；ZhuAX,etal.HCCandangiogenesis:possibletargetsandfuturedirections.NatRevClinOncol2011；8:292-301.)。目前HCC的治疗方法主要包括外科手术治疗、放疗、介入治疗及化学治疗等方式。近年兴起的免疫治疗，通过调节机体的免疫系统，提高其对肿瘤细胞的杀伤能力以及改善肿瘤的免疫抑制状态来实现对抗肿瘤的目的，因为在多种恶性肿瘤治疗中发挥了重要作用而备受关注，被称为肿瘤治疗最有前途的发展方向，其在HCC治疗中的应用也有相关的研究和报道(GretenTF,etal.CurrentconceptsofimmunebasedtreatmentsforpatientswithHCC:frombasicsciencetonoveltreatmentapproaches.Gut2015；64:842-848；PrietoJ,etal.Immunologicallandscapeandimmunotherapyofhepatocellularcarcinoma.NatRevGastroenterolHepatol2015；12:681-700)。免疫系统在慢性炎症向肿瘤的转化过程中扮演了极为重要而复杂的角色，肿瘤微环境中普遍存在一种特殊的T细胞功能紊乱现象，称为T细胞耗竭(Tcellexhaustion)。耗竭的T细胞主要呈现细胞活力、增殖能力及抗凋亡能力减弱，分泌效应细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF等)的能力及杀伤能力降低。在慢性炎症环境中，T细胞耗竭介导的低水平免疫状态，为肿瘤发生提供潜在可能，并且在肿瘤发生发展过程中，T细胞耗竭程度的加重逐渐导致抗肿瘤免疫减弱，从而使肿瘤免疫微环境变得更适宜肿瘤发展。耗竭T细胞在表面表达一系列免疫抑制性受体，如PD-1(programmedcelldeath-1)、CTLA-4(cytoSH2D1AicT-lymphocyteantigen-4)、LAG-3(lymphocyte-activationgene-3)、TIM-3(Tcellimmunoglobulinandmucin-domain-containingmolecule-3)、(KimPS,etal.FeaturesofrespondingTcellsincancerandchronicinfection.CurrOpinImmunol2010；22:223-230；HanahanD,etal.Hallmarksofcancer:thenextgeneration.Cell2011；144:646-674.)。T细胞耗竭，根据其程度分为可逆性的早期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平中等)，和不可逆的晚期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平很高)(WherryEJ,etal.MolecularandcellularinsightsintoTcellexhaustion.NatRevImmunol2015；15:486-499.)。针对早期耗竭的T细胞，给予阻断T细胞表面抑制分子的治疗，能够从一定程度上，恢复T细胞功能(WherryEJ,etal.MolecularandcellularinsightsintoTcellexhaustion.NatRevImmunol2015；15:486-499；FisicaroP,etal.AntiviralintrahepaticT-cellresponsescanberestoredbyblockingprogrammeddeath-1pathwayinchronichepatitisB.Gastroenterology2010；138:682-693,693e681-684；DayCL,etal.PD-1expressiononHIV-specificTcellsisassociatedwithT-cellexhaustionanddiseaseprogression.Nature2006；443:350-354；BarberDL,etal.RestoringfunctioninexhaustedCD8Tcellsduringchronicviralinfection.Nature2006；439:682-687.)。但是这种方法只能够部分改善早期耗竭的T细胞的功能，并且对逆转晚期耗竭T细胞的状态几乎没有作用。这可能也就是临床治疗中，很多肿瘤病人对应用PD-1，CTLA-4等抗体治疗不敏感的重要原因，因而，针对不可逆的晚期T细胞耗竭的研究，开发针对性阻碍效应T细胞向晚期耗竭发展，以及恢复这种晚期耗竭T细胞的功能的新的高效抗肿瘤药物，已经成为本领域亟待解决的技术难题。目前对T细胞耗竭的机制研究，已发现了多个在T细胞耗竭发生中具有重要调控作用的分子，如PSGL-1，NFAT，Blimp-1，TNF，GSK3等等，提示了这些可以作为潜在的逆转T细胞耗竭的治疗靶点(TinocoR,etal.PSGL-1IsanImmuneCheckpointRegulatorthatPromotesTCellExhaustion.Immunity2016；44:1190-1203.14；TaylorA,etal.GlycogenSynthaseKinase3InactivationDrivesT-bet-MediatedDownregulationofCo-receptorPD-1toEnhanceCD8(+)CytolyticTCellResponses.Immunity2016；44:274-28本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SH2D1A基因或其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物或制备抗肿瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.SH2D1A基因或其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物或制备抗肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列选自：1)如SEQIDNO.3～SEQIDNO.17所示的任一种核苷酸序列；2)将所述1)中的核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和/或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。3.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列选自：1)如SEQIDNO.3～SEQIDNO.17所示的任一种核苷酸序列；2)将所述1)中的核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代和/或缺失和/或添加与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。4.编码权利要求3所述的sgRNA的DNA分子。5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求3所述的sgRNA或权利要求4所述的DNA分子。6.权利要求3所述的sgRNA在敲除SH2D1A基因中的应用。7.CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除肝癌组织中浸润性CD8+T细胞中SH2D1A基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)SH2D1A-sgRNA的设计：根据SH2D1A的基因序列，PAM序列定位，选取位于SH2D1Aexon3上的5个位点设计sgRNA的核苷酸序列；所述序列如SEQIDNO.3-SEQIDNO.7中的任意一种所示；2)SH2D1A-sgR...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙倍成，何其峰，王晓琛，黄新立，夏安亮，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32