敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒，所述方法为利用CRISPR‑Cas9系统的构建方法，能够兼顾质量和效率，准确而高效。由于zDHHC17是一种重要的棕榈酰修饰酶，通过调控靶蛋白的棕榈酰化修饰修饰影响蛋白功能；zDHHC17又称为亨廷顿互作蛋白(Hip14)，与亨廷顿疾病的发病机理密切相关。敲除zDHHC17基因的N2a细胞系易于扩增培养，方便提供大量的生物样本，易于其靶标蛋白的发现研究；易于特异的研究其靶蛋白的调节功能及相关的信号通路。因此，敲除zDHHC17基因的N2a细胞系可用于其棕榈酰化底物的功能研究和亨廷顿疾病的发病机理研究。

N2a cell line knocking out zDHHC17 gene and its construction method and kit

The invention discloses a N2a cell line knocking out zDHHC17 gene and its construction method and kit. The method is a construction method using CRISPR Cas9 system, which can take into account both quality and efficiency, and is accurate and efficient. Because zDHHC17 is an important palmitoyl modifying enzyme, it affects the function of the target protein by regulating the palmitoylation modification; zDHHC17, also known as Huntington Interaction Protein (Hip14), is closely related to the pathogenesis of Huntington disease. N2a cell lines knocked out of zDHHC17 gene are easy to amplify and culture, provide a large number of biological samples, and facilitate the discovery and study of target proteins. It is also easy to specifically study the regulatory function of target proteins and related signaling pathways. Therefore, the N2a cell line knocking out zDHHC17 gene can be used to study the function of palmitoylation substrates and the pathogenesis of Huntington disease.

【技术实现步骤摘要】
敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒。
技术介绍
N2a细胞全称mouseneuroblastomaN2acells，也被称为Neuro-2a，是小鼠来源神经瘤母细胞。该细胞贴壁良好，多数成神经元样，具有轴突样结构；该细胞系主要用于实验室培养该细胞系作为体外病理研究的细胞模型；用于神经突增生、神经毒性、阿尔兹海默症和哺乳动物细胞系不对称分裂的研究。棕榈酰化修饰是一种可逆的蛋白质翻译后脂化修饰，影响蛋白质的结构和稳定性，调节蛋白的互作，转运及蛋白质的膜定位。人的棕榈酰化修饰由23种棕榈酰转移酶(zDHHCs)介导。棕榈酰化修饰在神经细胞中广泛存在，调节神经细胞的生长发育、细胞分化、突触的可塑性，并参与多种神经系统疾病的发生。亨廷顿疾病(HD)是一种常染色体显性遗传疾病，来源于染色体4p16.3短臂亨廷顿基因(HTT)中延伸的CAG重复(36以上重复)。亨廷顿疾病(HD)对人的神经功能有广泛的影响，引起大脑神经细胞渐进性退化，通常表现为行动障碍，认知及精神障碍。zDHHC17是棕榈酰化酶DHHC家族的一个重要成员。DHHC家族蛋白是一类重要的翻译后棕榈酰化修饰酶，在调节蛋白质的膜定位，蛋白质的分拣及蛋白质折叠和稳定性等重要生理过程中起重要作用。相关研究表明DHHC活性紊乱与神经疾病相关。zDHHC17又称为亨廷顿蛋白互作蛋白(Hip14)，能通过N端锚蛋白重复结构域(ANK)与亨廷顿蛋白(HTT)结合，调节HTT的棕榈酰化，参与亨廷顿疾病的发病过程。基因组编辑是研究基因功能的重要手段，目前已经发展出多种基因组编辑技术，例如ZFN技术、TALEN技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术。TALEN为转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)。ZFN为锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease)。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)，Cas是指CRISPR相关蛋白。CRISPR-Cas基因组编辑技术是通过一段RNA来识别打靶位点，通过Cas核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因组的定点编辑，因此该技术也叫做RNA指导的核酸内切酶技术。以上技术各有特点，根据要实现的基因组编辑效果选择适合的技术并优化技术方案是应用的关键，兼顾质量和效率是要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种准确高效地构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法。本专利技术提供的构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法，为基于CRISPR-Cas9系统的构建方法。优选地，所述方法以SEQIDNO:1所示zDHHC17基因序列中符合5′-20N-NGG-3′或5′-CCN-20N-3′序列排列规则的序列中的"20N"所示序列作为靶序列；N为A或T或C或G。优选地，所述靶序列为SEQIDNO:1所示zDHHC17基因序列的第264-283位或第298-317位。优选地，所述方法包括如下步骤(A)和(B):(A)包括如下步骤(a1)-(a3):(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如SEQIDNO:2所示；所述反向单链DNA1的序列如SEQIDNO:3所示；(a2)将所述正向DNA1和所述反向DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；(a3)将所述双链DNA1连接到pX458质粒的限制性内切酶BbsI的切割位点处，得到的重组质粒记为pX458-zDHHC17-1；(B)包括如下步骤(b1)-(b4):(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如SEQIDNO:4所示；所述反向单链DNA2的序列如SEQIDNO:5所示；(b2)将所述正向DNA2和所述方向DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；(b3)将所述双链DNA1连接到pX458质粒的限制性内切酶BbsI的切割位点处，得到的重组质粒记为pX458-zDHHC17-2；(b4)将所述pX458-zDHHC17-2质粒与(a3)所述pX458-zDHHC17-1质粒共转染N2a细胞，从转染后的N2a细胞中获得zDHHC17基因被敲除的N2a细胞系。优选地，步骤(a2)和步骤(b2)中，所述的退火反应的条件均为：95℃作用5min，95℃降温至25℃，降温速率为6℃/min；步骤(b4)中，将所述pX458-zDHHC17-1和pX458-zDHHC17-2质粒共转染N2a细胞时，所述pX458-zDHHC17-1和pX458-zDHHC17-2质粒的质量比为1：1。本专利技术的第二目的是提供敲除zDHHC17基因的N2a细胞系，所述细胞系为利用任一项所述的构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法获得的小鼠神经瘤母细胞N2a-KO-zDHHC17。本专利技术的第三目的是提供成套质粒，其由以上所述构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法中的所述pX458-zDHHC17-1质粒和所述pX458-zDHHC17-2质粒组成。其中所述成套质粒中的两种质粒可以分别单独包装，也可以按照质量比为1：1的比例混合包装。所述成套质粒的用途也属于本专利技术的保护范围，所述用途为基于CRISPR-Cas9敲除N2a细胞中的zDHHC17基因。本专利技术的第四目的是提供一种基于CRISPR-Cas9构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的试剂盒，所述试剂盒含有以上所述的成套质粒及说明书；所述说明书中记载有以上任一项所述构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法。所述的敲除zDHHC17基因的N2a细胞系在zDHHC17棕榈酰化底物的功能研究和亨廷顿疾病的发病机理研究中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的优点在于：本专利技术的构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法能够兼顾质量和效率，能够准确高效的获得敲除zDHHC17基因的N2a细胞系。打靶位点的特异性进行了反复的计算验证，利用荧光流式单细胞分选技术，提高了获取敲除细胞的效率，与普通的药物筛选相比大大缩短了细胞株筛选时间。敲除zDHHC17基因的N2a细胞系，或缺少zDHHC17基因的一部分，或由于敲除或插入某些片段而引起移码突变，故不能正确的表达zDHHC17蛋白，为了避免剪切变体的影响，敲除位点设计在各个变体的公共区域。由于zDHHC17是一种棕榈酰化修饰酶，zDHHC17蛋白的缺失导致其底物蛋白无法正常棕榈酰化修饰，无法正常行使蛋白功能，同时zDHHC17与亨廷顿疾病的发病机理相关；故敲除zDHHC17基因的N2a细胞系能够用于其修饰底物的功能研究及亨廷顿疾病的发病机理研究。敲除zDHHC17基因的N2a细胞是敲除zDHHC17基因小鼠的补充与扩展，与敲除zDHHC17基因的小鼠相比，敲除zDHHC17基因的N2a细胞更容易获得大量的生物样本，通过质谱进行棕榈酰蛋白组学分析，获取zDHHC17潜在的靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法，其特征在于，所述方法为基于CRISPR‑Cas9系统的构建方法。

【技术特征摘要】
1.构建敲除zDHHC17基因的N2a细胞系的方法，其特征在于，所述方法为基于CRISPR-Cas9系统的构建方法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法以SEQIDNO:1所示zDHHC17基因序列中符合5′-20N-NGG-3′或5′-CCN-20N-3′序列排列规则的序列中的"20N"所示序列作为靶序列；N为A或T或C或G。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶序列为SEQIDNO:1所示zDHHC17基因序列的第264-283位或第298-317位。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤(A)和(B):(A)包括如下步骤(a1)-(a3):(a1)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA；所述正向单链DNA1的序列如SEQIDNO:2所示；所述反向单链DNA1的序列如SEQIDNO:3所示；(a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1；(a3)将所述双链DNA1连接到pX458质粒的限制性内切酶BbsI的切割位点处，得到的重组质粒记为pX458-zDHHC17-1；(B)包括如下步骤(b1)-(b4):(b1)合成名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA；所述正向单链DNA2的序列如SEQIDNO:4所示；所述反向单链DNA2的序列如SEQIDNO:5所示；(b2)将所述正向单链DNA2和所述反向DNA2进行退火反应，得到双链DNA2；(b3)将所述双链DNA1连接到pX458质粒的限制性内切酶BbsI的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧聪，饶木顶，焦雪苗，吴灿，孔二艳，张中健，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41