一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明专利技术以杆状病毒表达的RVFV糖蛋白Gn和Gc作为抗原，从一例裂谷热康复患者的PBMCs中筛选到可以结合RVFV糖蛋白Gn和Gc的记忆B细胞，且通过单一B细胞测序、体外中和以及体内保护等实验，鉴定出8株高效中和RVFV感染的Gn人源单克隆抗体以及一株Gc人源单克隆抗体。本发明专利技术的人源单克隆抗体具有非常高的体外中和活性(IC50可低至1.93±0.6pM，达到pM级)，可以有效治疗被RVFV感染的小鼠，预防RVFV对小鼠的感染，具有极高的临床治疗和预防RVFV感染的应用价值。

A Human Monoclonal Antibody Against Rift Valley Fever Virus and Its Application

The invention discloses a human monoclonal antibody of Rift Valley fever virus and its application, which belongs to the technical field of medicine. The present invention uses RVFV glycoprotein Gn and GC expressed by baculovirus as antigens to screen memory B cells that can bind RVFV glycoprotein Gn and GC from PBMCs of a RVFV rehabilitative patient. Through single B cell sequencing, in vitro neutralization and in vivo protection experiments, eight highly effective human Gn monoclonal antibodies neutralizing RVFV infection and one human Gc monoclonal antibody were identified. The human monoclonal antibody of the invention has very high neutralization activity in vitro (IC50 can be as low as 1.93 + 0.6 pM, reaching pM level), can effectively treat mice infected with RVFV, prevent RVFV infection in mice, and has very high clinical therapeutic and preventive value of RVFV infection.

【技术实现步骤摘要】
一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及一种裂谷热病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药

技术介绍
裂谷热病毒(RiftValleyfevervirus，RVFV)是严重威胁人类和动物健康的虫媒病毒之一，属于布尼亚病毒目(Bunyavirale)白细病毒科(Phenuiviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)，可引起人畜共患病裂谷热(RiftValleyfever，RVF)，致牲畜死亡和流产。其表面覆有囊膜及糖蛋白突起，由3段负链RNA构成病毒基因组(S、M和L)，其中，M片段编码表面糖蛋白Gn和Gc，且在Gn的5’端编码非结构蛋白(NSm)，而Gn和Gc是病毒的主要囊膜蛋白，是病毒进行入侵和膜融合的关键蛋白；其传播范围十分广，绵羊、山羊、牛、水牛、骆驼等家畜均可感染该病毒；其致死率十分高，尤其是年幼的动物，一旦感染，病死率接近100％。人也会感染RVFV，且多数症状轻微，可自愈，但是，也有部分患者出现重症，其中，5-10％的患者的视网膜会产生退行性病变，重者可导致单眼或双眼永久性失明；<1％的患者会出现出血热，其中，50％的患者会死亡；<1％的患者会出现脑炎，出现此症状的患者虽死亡率不高，但通常会留下严重的后遗症，如偏瘫等。就时间上来说，1930年，科学家Danbney等在肯尼亚大裂谷的一次绵羊疾病暴发调查中首次分离到RVFV，自此，人们发现RVF疫情会在动物和人类中定期暴发，造成重大损失。例如，1977-1978年，RVF疫情在埃及暴发，当时共计有20万人感染，其中包括18,000例重症患者及600例死亡病例；而自2000年到2018年6月，全球共向世界卫生组织(WHO)通报了4830例重症RVF病例，其中包括967例死亡病例，死亡率约为20.0％。就地域上来说，通常，RVFV在非洲地区流行。但是，2000年9月，阿拉伯半岛(沙特阿拉伯和也门)也暴发了RVF疫情，这也是首个非洲以外地区报道该疫情；2016年，我国也出现一例输入病例，该患者从安哥拉返回中国。就传播方式上来说，RVFV主要通过蚊虫叮咬传播。已知的可传播本病的蚊子种类多达30种，分布在北极以外的其它各个大陆，因此，RVFV继续向世界扩散的风险非常高。目前，针对动物的RVFV感染的有效预防手段是疫苗。在兽用疫苗方面，肯尼亚和南非使用RVFV的减毒活疫苗，埃及和南非使用福尔马林灭活疫苗。通常，减毒活疫苗仅在绵羊免疫中有效，不能保护牛，且副作用较高，经常引起母羊流产；福尔马林灭活疫苗虽具有更高的安全性，但存在成本高、免疫不持久的问题。而其它种类疫苗仍在研究阶段，包括：DNA疫苗、基因工程改造株、VLPs等。针对人群的RVFV感染的有效预防手段主要仍是通过免疫家畜、切断传染源。此外，非洲地区的高危人群可接种福尔马林灭活疫苗，但是由于成本问题，不可能大范围接种。人患病后，病毒唑(ribavirin)可能会有治疗效果，但目前临床数据不多。因此，亟需研究出有效的RVFV感染治疗药物，尤其是可治愈重症患者的治疗。在这方面，抗体显示出巨大潜力。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术对RVFV疫苗进行了研究，发现单独的Gn或是Gn与Gc一起的疫苗形式可有效产生RVFV的中和抗体，也就是说，针对Gn或Gc的抗体极有可能中和RVFV的感染，成为治疗RVFV感染的药物。因此，本专利技术以杆状病毒表达的RVFV糖蛋白Gn和Gc作为抗原，从一例裂谷热康复患者的PBMCs中筛选到可以结合RVFV糖蛋白Gn和Gc的记忆B细胞，且通过单一B细胞测序、体外中和以及体内保护等实验，鉴定出8株高效中和RVFV感染的Gn人源单克隆抗体(R4、R12、R13、R15、R16、R17、R19、R22)以及一株Gc人源单克隆抗体(R5)。本专利技术的人源单克隆抗体具有非常高的体外中和活性(IC50可低至1.93±0.6pM，达到pM级)，可以有效治疗被RVFV感染的小鼠，预防RVFV对小鼠的感染，具有极高的临床治疗和预防RVFV感染的应用价值。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链以及轻链；所述重链包含重链可变区以及重链恒定区；所述轻链包含轻链可变区以及轻链恒定区；所述抗体或抗原结合片段命名为R4，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R12，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R13，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R15，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R16，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R17，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R19，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R22，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R5，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述R4、R12、R13、R15、R16、R17、R19、R22以及R5的重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述R4、R12、R13、R15、R16、R17以及R5的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:20所示；所述R19以及R22的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述R4、R12、R13、R15、R16、R17以及R5的重链与轻链均通过EcoRI和XhoI连接；所述R19和R22的重链通过EcoRI和XhoI连接，轻链通过SacI和XhoI连接。本专利技术提供了编码上述抗体或抗原结合片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码重链的核苷酸序列以及编码轻链的核苷酸序列；所述编码重链的核苷酸序列依次包含CMV启动子序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列；或所述编码重链的核苷酸序列依次包含CMV启动子序列、连接序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、连接序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列不包含连接序列时，所述编码重链的核苷酸序列之间可通过PCR相连。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列包含连接序列时，所述连接序列可为酶切位点序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码重链的核苷酸序列包含连接序列时，所述编码重链的核苷酸序列依次包含CMV启动子序列、E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链以及轻链；所述重链包含重链可变区以及重链恒定区；所述轻链包含轻链可变区以及轻链恒定区；所述抗体或抗原结合片段命名为R4，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R12，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R13，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R15，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R16，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R17，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R19，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R22，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R5，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。...

【技术特征摘要】
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链以及轻链；所述重链包含重链可变区以及重链恒定区；所述轻链包含轻链可变区以及轻链恒定区；所述抗体或抗原结合片段命名为R4，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R12，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R13，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R15，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R16，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R17，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R19，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R22，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示；或所述抗体或抗原结合片段命名为R5，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示且轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。2.如权利要求1所述的一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述R4、R12、R13、R15、R1...

【专利技术属性】
技术研发人员：严景华，王奇慧，马桐，杨化冰，高福，马素芳，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11