一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用技术

本发明专利技术涉及酶联免疫技术领域，公开了一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用。本发明专利技术以果蝇卵细胞作为表达Her2全长蛋白的宿主细胞，联合适宜的昆虫细胞表达载体、筛选方法、细胞传代扩增方法以及蛋白纯化方法组成系统的Her2全长蛋白表达纯化方法，获得了毫克级以上的目标蛋白，并具备较佳的抗原性和与抗Her2单抗结合的特异性，可通过夹心ELISA法有效识别血清中Her2的含量，对乳腺癌的诊断分型和预后有重要指导作用。

A Method for Expressing and Purifying Her2 Full-length Protein and Application of Her2 Full-length Protein

The invention relates to the field of enzyme-linked immunoassay technology, and discloses a method for expressing and purifying Her2 full-length protein and the application of Her2 full-length protein. The present invention uses Drosophila eggs as host cells expressing Her2 full-length protein, combines suitable insect cell expression vectors, screening methods, cell passage amplification methods and protein purification methods to form a system of Her2 full-length protein expression and purification methods, obtains target proteins of more than milligram level, and has better antigenicity and specificity of binding with anti-Her2 monoclonal antibodies. Sandwich ELISA can effectively identify the content of Her2 in serum, which plays an important role in the diagnosis, classification and prognosis of breast cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用
本专利技术涉及酶联免疫
，具体涉及一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法以及Her2全长蛋白的应用。
技术介绍
乳腺癌细胞有三种重要受体：雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)和HER2。ER+癌细胞(即具有雌激素受体的癌细胞)依赖于雌激素的生长，可以用药物治疗以阻断雌激素效应(例如他莫昔芬)，且预后较好。HER2+癌细胞用单克隆抗体曲妥珠单抗(联合常规化疗)的药物有一定的疗效，并改善了预后。不含任何这三种受体类型的乳腺癌细胞(雌激素受体，孕激素受体或HER2)被称为三重阴性，对上述治疗不敏感且预后较差。Her2是跨膜蛋白有膜外膜中和膜内3部分组成。癌细胞裂解Her2可释放到血清中，膜外部分可从肿瘤细胞表面脱落进入循环，这使得在血清中队HER2的检测可行。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中的HER2被广泛研究。曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体，它通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长。它可将1-3期HER2阳性乳腺癌的5年无病生存率提高到87％(总生存率95％)。通过测血清中Her2含量作为筛查乳腺癌的一种方式，不仅对身体无副作用，还能有助于预测对曲妥珠单抗治疗的反应对是否采取曲妥珠单抗治疗方案以直观的指示，但曲妥珠单抗不仅昂贵且对心脏毒性有关。Her2全长蛋白由于其特殊性，难以成功的在常规细胞中表达并纯化出可用的Her2全长蛋白，目前仅有的表达Her2全长蛋白普遍是采用乳腺癌细胞株，但是采用乳腺癌细胞株表达Her2全长蛋白，只适用于一般的功能检测和课题研究，只有纳克级，而能够表达并纯化出Her2全长蛋白至少需要达到毫克级别。因此，能够成功表达并纯化出Her2全长蛋白将对检测血清中Her2含量有很重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，使得所述方法能够成功表达并纯化出Her2全长蛋白，具备较佳的抗原性，并能够和抗Her2单抗特异性结合；本专利技术的另外一个目的在于提供以上述Her2全长蛋白为基础的乳腺癌检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，包括：步骤1、合成Her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞；步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*106个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞；步骤4、用含500uM硫酸铜诱导剂的无血清培养基重悬细胞，并诱导表达72小时，收集上清表达液；步骤5、上清表达液进行Ni-NTA蛋白纯化，获得Her2全长蛋白。针对目前缺少表达并纯化出Her2全长蛋白的方法，本专利技术选择果蝇卵细胞为表达载体，并制定了一套与之相适宜的表达载体和表达方法，最终表达并纯化出可以直接用于ELISA检测中的毫克级以上的Her2全长蛋白。在本专利技术步骤1中，全基因两端酶切位点的设计需要和后续连接的昆虫细胞表达载体相一致，在本专利技术具体实施方式中，本专利技术的酶切位点选择为NcoI和XhoI，昆虫细胞表达载体选择市售的pMT/Bip/V5-A。其上，同样具备NcoI和XhoI酶切位点，可顺利连接。在本专利技术步骤2中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞，根据所选择的昆虫细胞表达载体所具备的筛选标记进行筛选。例如本专利技术所选择的pMT/Bip/V5-A，其上pUCori是表达抗药基因，可采用对应的purimycin筛选。同时，本专利技术在选择昆虫细胞表达载体上同样兼顾了后续的蛋白纯化步骤，本专利技术所选择的pMT/Bip/V5-A，其还具备His标签，可采用Ni-NTA蛋白纯化，其中步骤5的Ni-NTA蛋白纯化具体如下：步骤5.1、平衡Ni-NTA柱；步骤5.2、在上清表达液里混合Tris-buffersaline并一同加入柱子，控制流速为0.5ml/min；步骤5.3、收集滤下的样品，重复上一步骤1次或多次；步骤5.4、Tris-buffersaline洗涤，同时测定OD280nm，直到没有蛋白流出为止；步骤5.5、Tris-buffersaline洗杂，收集滤液，直至OD280nm测定没有蛋白流出为止；步骤5.6、Tris-buffersaline洗脱，收集每管洗脱液，测定OD280nm并电泳检测所收集的洗脱液，检测出目标蛋白，然后透析获得Her2全长蛋白。相对于大肠杆菌等表达宿主，果蝇卵细胞并不是本领域常规表达细胞，故本专利技术所述果蝇卵细胞传代扩增采用Schneider果蝇培养基培养传代扩增。作为优选，含500uM硫酸铜诱导剂的无血清培养基同样采用Schneider果蝇培养基。本专利技术以果蝇卵细胞(S2)、大肠杆菌感受态细胞(E.coli)、人肾细胞(HKcells)、人类永生化表皮细胞(Hacatcells)和小鼠胃癌细胞(MFCcells)为Her2全长蛋白的表达细胞进行对比试验，结果显示，在参照本专利技术表达方法的基础上，只有果蝇卵细胞能够表达出Her2全长蛋白，而其余常规细胞无法表达出Her2全长蛋白。采用本专利技术方法获得的Her2全长蛋白经Westernblot检测Her2的抗原性，结果显示0.1μg、0.05μg和0.025μg的Her2全长蛋白均能够与HRP标记的抗Her2膜外部分的单克隆抗体结合并显色，条带清晰；同时，采用免疫沉淀的方法对Her2膜外部分单克隆抗体进行特异性验证，结果显示，乳腺癌细胞裂解液，用IgG沉淀后无条带；本专利技术纯化后的Her2全长蛋白以及乳腺癌细胞裂解液，用Her2抗体沉淀后可结合显示出条带；上皮细胞裂解液，用Her2抗体沉淀后无条带。基于上述较佳的抗原性和与Her2抗体结合的特异性，本专利技术提供了一种乳腺癌夹心ELISA法检测试剂盒，包括本专利技术所述方法制备的Her2全长蛋白。作为优选，还包括如下组分的一种或两种以上：包被有抗Her2单克隆抗体1的载体、PBS-T、连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2和TMB。此外，本专利技术还提供了一种检测Her2含量的方法，包括：步骤1、将本专利技术所述方法制备的Her2全长蛋白分别稀释为100ng/100ul、80ng/100ul、60ng/100ul、40ng/100ul梯度浓度，0ng/100ul作为阴性对照，包被有抗Her2单克隆抗体1的载体上每个孔加入梯度浓度样本100ul，做复孔，室温2小时孵育；步骤2、用PBS-T洗涤，加连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；步骤3、用PBS-T洗涤，加酶底物TMB显色10分钟，测OD450nm值，绘制标准曲线，待用；步骤4、加待测血清至包被有抗Her2单克隆抗体1的载体上，室温2小时孵育；步骤5、用PBS-T洗涤，加连接酶HRP的抗Her2的单克隆抗体2，室温1小时孵育；步骤6、用PBS-T洗涤，加酶底物TMB显色10分钟，测OD450nm值，代入到步骤3中的标准曲线，获得待测血清中Her2含量。上述检测方法在0-100ng/100ulHer2里有良好的线性区间，同时可有效识别血清中Her2的含量，对乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，其特征在于，包括：步骤1、合成Her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞；步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*10

【技术特征摘要】
1.一种表达和纯化Her2全长蛋白的方法，其特征在于，包括：步骤1、合成Her2全基因，并在全基因两端设计酶切位点，通过酶切连接至昆虫细胞表达载体，获得重组载体；步骤2、将所述重组载体转染至果蝇卵细胞中，通过筛选获得稳定表达Her2全长蛋白的果蝇卵细胞；步骤3、将所述果蝇卵细胞传代扩增至细胞浓度为2*106个/ml时，离心去掉上清液，留存细胞；步骤4、用含500uM硫酸铜诱导剂的无血清培养基重悬细胞，并诱导表达72小时，收集上清表达液；步骤5、上清表达液进行Ni-NTA蛋白纯化，获得Her2全长蛋白。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶切位点为NcoI和XhoI。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述昆虫细胞表达载体为携带pac基因和His标签的昆虫细胞表达载体。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述昆虫细胞表达载体为pMT/Bip/V5-A。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述果蝇卵细胞传代扩增采用Schneider果蝇培养基培养传代扩增。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述无血清培养基为Schneider果蝇培养基。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5为：步骤5.1、平衡Ni-NTA柱；步骤5.2、在上清表达液里混合Tris-buffersaline并一同加入柱子，控制流速为0.5ml/min；步骤5.3、收集滤下的样品，重复上一步骤1次或多次；步骤5.4、Tris-buffersaline洗涤，同时测定OD280nm，直到没有蛋白流出为止；步骤5.5、Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海瑶，张永顶，马伟民，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44