碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲液，所述的洗脱缓冲液为碳酸氢钠溶液，其浓度为5mM，pH为6.7‑7.2。本发明专利技术还提供了碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用，所述的碳酸氢钠缓冲体系为碳酸氢钠缓冲液，其浓度为5mM，pH7.0。本发明专利技术还提供了含有精氨酸的裂解液在核酸检测试剂盒中的应用，在所述的裂解液中，所述的精氨酸的浓度为15mM。本发明专利技术提供了一种缓冲体系，从而提高核酸（主要为DNA）的分析灵敏度。本发明专利技术在不改变RNA提取效率的条件下，增加了DNA的提取效率，从而增加了产品的DNA检测的分析灵敏度。

Application of Sodium Bicarbonate Buffer System in Nucleic Acid Extraction

The present invention provides an elution buffer for a nucleic acid detection kit. The elution buffer is a sodium bicarbonate solution with a concentration of 5 mM and a pH of 6.7 7.2. The invention also provides the application of sodium bicarbonate buffer system in nucleic acid extraction. The sodium bicarbonate buffer system is sodium bicarbonate buffer solution with a concentration of 5 mM and a pH of 7.0. The invention also provides the application of a pyrolysis solution containing arginine in a nucleic acid detection kit, in which the concentration of arginine is 15 mm. The present invention provides a buffer system to improve the analytical sensitivity of nucleic acid (mainly DNA). Without changing the efficiency of RNA extraction, the invention increases the efficiency of DNA extraction, thereby increasing the analytical sensitivity of DNA detection of products.

【技术实现步骤摘要】
碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用
本专利技术属于生物医学领域涉及一种核酸的提取技术，具体来说是碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用。
技术介绍
乙型病毒性肝炎是由乙型病毒肝炎(以下简称HBV)感染导致的肝炎疾病，具有传染性，可经肝硬化发展为肝癌，对健康危害极大，而有效地诊断能够大量避免乙肝病毒感染。我国是乙肝大国，目前约有1.2亿乙肝病毒携带者，因此，乙肝的诊断非常重要。另外，丙型肝炎病毒(以下简称HCV)和人类免疫缺陷病毒(以下简称HIV)对健康也有着巨大的威胁。目前，上述病毒的主要检测手段为免疫分析技术(如酶联免疫)和分子生物技术(如PCR)等，前者的待检物主要为蛋白，后者的待检物主要为核酸，后者因其较高的分析灵敏度和特异性，将成为未来诊断的发展方向。然而，如何进一步提高核酸检测的分析灵敏度，从而有效地检测出早期感染者，避免因输血的环节造成交叉感染，从而有效地控制感染者的数量便显得尤为重要。本公司拥有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1型)核酸检测试剂盒(以下简称本产品)，可同时有效地检测HBV，HCV和HIV。本产品主要包含核酸提取和扩增检测两部分。在核酸提取部分，本产品采用磁珠法提取核酸，提取过程分为核酸吸附，洗涤和洗脱3个部分。在核酸吸附部分中，本产品主要通过硅羟基与离液剂(或酸性环境)，在高盐(离子强度)浓度的条件下来分离和吸附核酸。在核酸洗脱部分中，本产品在高温条件下通过碱性和低盐(离子强度)浓度条件下来洗脱核酸，最终达到分离和纯化核酸的目的。通常，洗脱的pH条件多为中性或碱性(pH7.0-8.5)，洗脱缓冲体系以Tris-HCl缓冲体系为主。目前，绝大多数核酸提取产品(包括本产品)采用Tris-HCl缓冲体系作为洗脱缓冲体系。但由于该缓冲体系的pH随温度变化明显(温度每升高10℃，pH约降低0.3)，故中性的Tris-HCl缓冲体系在高温条件下容易变酸性，从而降低核酸(主要为DNA)的洗脱效率。通常的解决方案是将Tris-HCl的pH调节至弱碱性(pH8.0-8.5)，但该pH条件下，核酸(主要为RNA)变得不稳定。因此如何找到与温度变化无关的缓冲体系便显得尤为重要。由此可见，现有产品的分析灵敏度有进一步提高的空间。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用，所述的这种碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用要解决现有技术中温度变化会导致Tris-HCl缓冲体系作为提取缓冲液的核酸检测试剂盒分析灵敏度降低的技术问题。本专利技术提供了一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲液，所述的洗脱缓冲液为碳酸氢钠溶液，其浓度为5mM，pH为6.7-7.2。进一步的，所述的碳酸氢钠溶液的pH为7.0。本专利技术还提供了碳酸氢钠缓冲体系在核酸提取中的应用，所述的碳酸氢钠缓冲体系为碳酸氢钠溶液，其浓度为5mM，pH7.0。本专利技术提供了一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲体系，即浓度为5mM的pH7.0碳酸氢钠缓冲体系(pH6.7-7.2)，该缓冲体系结合其他组份(如浓度为0.05％的Tween和TritonX-100)可作为洗脱液，用于核酸提取。本专利技术还提供了含有精氨酸的裂解液在核酸检测试剂盒中的应用，在所述的裂解液中，所述的精氨酸的浓度为15mM。在本核酸检测试剂盒的裂解液(核酸吸附部分)中加入15mM精氨酸(以下简称含精氨酸的裂解液)能够同样达到提高HBV分析灵敏度的目的。本专利技术的碳酸氢钠缓冲体系作为一种有效的洗脱缓冲体系在核酸(主要为DNA)提取使用时，可以提高分析灵敏度。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术提供了一种缓冲体系，从而提高核酸(主要为DNA)的分析灵敏度。本专利技术在不改变RNA提取效率的条件下，增加了DNA的提取效率，从而增加了产品的DNA检测的分析灵敏度。附图说明图1为分析灵敏度各项指标的检出率随碳酸氢钠洗脱液pH变化趋势图。图2为pH7.0洗脱液随37℃放置天数的变化趋势图。图3为不同提取和洗脱条件下的检出率比较图。具体实施方式实施例1一、研究概述：本研究的主要对象为碳酸氢钠缓冲液的pH，研究分为缓冲体系pH的确定和验证两部分。在缓冲体系pH的确定部分中，利用梯度搜索法在pH6.4-8.0的范围中找到合适的pH。在缓冲体系pH的验证部分中，对合适的pH的热稳定性进行验证，以初步确认该pH的适用性。本研究主要方法为功能性试验(组分替换法)，即将本产品中的相关组分替换为待研究组分，并以分析灵敏度为指标对待研究组分进行评估。其中，1.1分析灵敏度样本浓度：HBV：5IU/mL；HCV：50IU/mL；HIV：50IU/mL1.2样本量：201.3评估标准：检出率≥95％(19/20)二、碳酸氢钠缓冲体系pH的确定：如前所述，我们将试剂盒洗脱液中的缓冲体系替换为5mM的不同pH(pH6.4-8.0)的碳酸氢钠缓冲体系(以下简称碳酸氢钠洗脱液)，其他组分不变，并以分析灵敏度为检测项进行检测，以筛选和确定合适的pH。表1：不同pH碳酸氢钠洗脱液下分析灵敏度各项指标的检出率注：1)HBV检出率#为在原HBV反应液中添加一对针对HBVS基因的引物探针HBVS的检测结果；2)pH7.5的数据为洗脱液37℃放置3天的测试结果(初次实验结果为HBV：20/20，HCV：20/20，HIV：19/20)，由于37℃放置3天结果不合格，故该pH不予采用；3)提取试剂批号均为20170102，扩增试剂批号均为20180202，磁珠均为20#；4)pH测定均采用pH试纸；5)pH8.0的HBV检出结果可能为异常数据。注：1提取试剂批号均为20170102，扩增试剂批号均为20180202，磁珠均为20#2pH测定均采用pH试纸3pH8.0的HBV检出结果可能为异常数据实验结果(表1和图1)表明，缓冲液pH对HBV和HIV有一定影响，在偏酸的条件下，HBV检出率不达标，增加一对引物探针有利于稳定HBV的检出率，在偏碱的条件下，HIV检出率不达标，HCV受pH影响较小。综合上述结果，浓度为5mM的pH7.0的碳酸氢钠缓冲液能够通过评估。三、热稳定性的验证：如前所述，我们对pH6.7、7.0和7.2的碳酸氢钠缓冲液的热稳定性(亦可视为重现性)进行了验证。表2：不同pH碳酸氢钠洗脱液的热稳定性实验结果(分析灵敏度各项指标的检出率)注：1)1提取试剂批号均为20170102，扩增试剂批号均为20180202，磁珠均为20#；2)2pH测定均采用pH试纸；3)3洗脱液放置环境为37℃空气浴。注：1)1提取试剂批号均为20170102，扩增试剂批号均为20180202，磁珠均为20#。2)2pH测定均采用pH试纸。3)3分析灵敏度各检测项的样本量均为20。实验结果(表2和图2)表明，pH7.0的碳酸氢钠洗脱液的分析灵敏度各检测项的检测结果不随37℃放置天数(3、5和7d)变化，pH6.7、7.0和7.2的碳酸氢钠缓冲液在37℃放置7天后，各项检测指标均达标。pH试纸测定结果显示，各缓冲液在37℃放置7天后，其pH略有升高(约0.1-0.2)。对比例本研究的主要对象为浓度为5mM的pH7.0的碳酸氢钠缓冲，通过与pH7.5的Tris-HCL洗脱缓冲体系(本产品的洗脱缓冲体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲液，其特征在于：所述的洗脱缓冲液为碳酸氢钠溶液，其浓度为5mM，pH为6.7‑7.2。

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲液，其特征在于：所述的洗脱缓冲液为碳酸氢钠溶液，其浓度为5mM，pH为6.7-7.2。2.根据权利要求1所述的一种用于核酸检测试剂盒的洗脱缓冲液，其特征在于：所述的碳酸氢钠溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁硕，方琴，张健，蒋淼，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31