本发明专利技术涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用；一种改良嵌合抗原受体T细胞，其特征在于所述T细胞在病毒转导过程中，将包括CAR在内的三种慢病毒同时转导入T细胞；对现有的CAR‑T细胞进行改造，同时将三种慢病毒共转导入T细胞，一方面既可以发挥CAR对肿瘤的特异靶向作用，并对肿瘤进行杀伤；另一方面，转导入细胞的IL‑7及IL‑15因子同样可促进CAR‑T细胞在体外的有效增殖，省去了实验过程中需多次加入IL‑7及IL‑15因子，简化实验步骤，并可减少CAR‑T制剂在制备过程中的成本。
Preparation and Application of a Modified Chimeric Antigen Receptor T Cell
The invention relates to the technical field of cellular immunotherapy, in particular to the preparation and application of an improved chimeric antigen receptor T cell; an improved chimeric antigen receptor T cell, which is characterized by the simultaneous transduction of three lentiviruses, including CAR, into T cells during viral transduction; the transformation of existing CAR T cells and the co-transduction of three lentiviruses at the same time. Introducing T cells can not only exert the specific targeting effect of CAR on tumors, but also kill tumors. On the other hand, IL_7 and IL_15 factors can also promote the effective proliferation of CAR_T cells in vitro, eliminating the need to add IL_7 and IL_15 factors many times in the experimental process, simplifying the experimental steps, and reducing the formation of CAR_T preparations in the preparation process. Ben.
【技术实现步骤摘要】
一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用
本专利技术涉及细胞免疫治疗
，特别涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor)T细胞技术是不受免疫系统MHC的限制性，通过基因改造技术能够对肿瘤细胞特异靶向，从而对肿瘤进行杀伤的一种发展迅速的细胞治疗技术。自2017年FDA批准了诺华公司的Tisagenlecleucel以及Kite的AxicabtegeneCiloleucel两种CAR-T细胞产品上市以来，其分别用于治疗儿童和年轻人B细胞急性淋巴性白血病以及成人复发性或难治性大B细胞淋巴瘤，CAR-T免疫疗法在针对血液瘤涉及急性B淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤以及多发性骨髓瘤等的治疗方面取得了显著成效。并且美国医保与医助服务中心(CentersforMedicareandMedicaidServices,CMS)于2019年2月15日正式发布拟议决定备忘录：批准CAR-T细胞治疗正式纳入医保。这使得CAR-T疗法能够更快速的运用于临床，为患者带来福音。据《2018年全球癌症统计数据》显示中国癌症的发病人数及死亡人数均为世界第一。肺癌、乳腺癌以及结直肠癌为全球发病率最高的三种癌症，而死亡率最高的则分别为肺癌、结直肠癌和胃癌。尽管CAR-T疗法在血液瘤中取得显著的进展，而其针对实体瘤的治疗特别是关于结直肠癌的治疗仍有待解决。为了获得较好的临床结果，确保CAR-T回输制剂的质量尤为重要，包括CAR-T制剂的细胞量、病毒的转导效率等。这需要在体外培养过程中慢病毒能够高效转导，并且细胞能够有效的增殖。目前常用的促进CAR-T细胞扩增的因子有IL-2或是IL-7/IL-15。在naiveT细胞被激活后，效应T细胞可分泌IL-2并且增加IL-2受体的表达，从而促进T细胞的增殖。目前IL-2已经是公认的促进T细胞增殖的细胞因子。但是其本身对体内存在的restingnaiveT细胞及记忆T细胞的促增殖作用有限。IL-7可通过Jak-STAT通路及pI3K-AKt通路一方面抑制细胞凋亡，提高细胞存活；另一方面诱导周期蛋白的表达，促进细胞周期进展，从而促进naiveT细胞及记忆T细胞的增殖。IL-15与其受体结合后主要通过JAK1/STAT3、JAK3/STAT5以及Ras/MAPK三条信号通路发挥作用，通过增生信号的增强以及凋亡信号的减弱，从而增加CD8+T细胞的免疫应答。在CAR-T细胞制剂制备过程中，上述促进细胞增殖的因子常常是额外添加至T细胞的培养体系中。而市售重组人源化的IL-7因子1mg售价在4680美元，重组人源化的IL-15因子1mg售价在4000美元左右，在T细胞培养过程中，需要多次加入相应的因子，细胞因子的用量较大，极大提高了CAR-T细胞制备的成本，并且还需要确保不同批次细胞因子产品的质量。CN109055430A公开了一种共表达IL-18和CCL19蛋白及靶向MUC1基因CAR-T细胞的制备方法。可以在CAR的设计过程中加入IL-18及CCL19基因，从而使CAR-T细胞共表达IL-18及CCL19因子，既可促进T细胞增殖，也能募集更多的T细胞以及DC细胞至肿瘤组织一起杀伤肿瘤。尽管慢病毒载体能够稳定表达，但是其载体的容量小，最大只能容纳约8Kb的目的基因。而目前在CAR的设计过程中，除了特异性识别肿瘤抗原的抗体外，还包括诱导CAR-T死亡的自杀基因等。若再额外加入多个基因，则可能会超过慢病毒载体的容量，影响病毒包装。因此，本专利技术提供了一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备及其应用。在含CAR基因病毒转导的过程中，同时将构建的IL-7、IL-15慢病毒转入T细胞，获得三基因共表达的T细胞。降低成本的同时，内源性的IL-7及IL-15同样能够有效促进细胞增殖来杀伤肿瘤细胞。从而使CAR-T细胞免疫疗法得到更好的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种改良的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于同时将构建的包括CAR在内的三种慢病毒共转导入T细胞，一方面既可降低CAR-T制剂制备过程中的生产成本，另一方面又不影响CAR-T在体外的增殖情况。为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：(1)采集健康人外周血，经密度梯度分离获得外周血单个核细胞，分选后获得纯化的T细胞；(2)T细胞激活后，取出三种慢病毒进行离心共转导，随即吸弃病毒上清，更换培养液继续培养；(3)将步骤(2)转导后的T细胞进行流式分析，培养后即得到改良的嵌合抗原受体T细胞。优选地，步骤(1)中所述的分选采用磁珠阴性分选法。优选地，步骤(2)所述的激活采用anti-CD3/anti-CD28偶联的磁珠进行激活，激活时采用的磁珠与T细胞的加入比例为1:1～3:1。优选地，三种慢病毒分别包括IL-7、IL-15及靶向实体瘤的CAR三种慢病毒，其中IL-7慢病毒的MOI为5-25，IL-15慢病毒的MOI为5-25，CAR慢病毒的MOI为5-25。优选地，步骤(2)中离心共转导，采用的离心转速为2000-3000rpm，离心时间为1-3h。优选地，步骤(3)中于转导后48h进行流式分析转导效率。优选地，改良嵌合抗原受体T细胞在制备过程中所用的完全培养基为RPMI-1640基础培养基，包括10％的胎牛血清，1％的青霉素-链霉素双抗以及500IU/mL的IL-2。由于IL-7及IL-15对T细胞增殖的显著促进作用，本专利技术中将IL-7及IL-15基因包装成慢病毒之后与携带CAR基因的慢病毒一起共转导入T细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于，对现有的CAR-T细胞进行改造，同时将三种慢病毒共转导入T细胞，一方面既可以发挥CAR对肿瘤的特异靶向作用，并对肿瘤进行杀伤；另一方面，转导入细胞的IL-7及IL-15因子同样可促进CAR-T细胞在体外的有效增殖，省去了实验过程中需多次加入IL-7及IL-15因子，简化实验步骤，并可减少CAR-T制剂在制备过程中的成本。附图说明图1为改良嵌合抗原受体T细胞制备的流程示意图；图2为健康人T细胞活化前后的示意图，其中A为激活前T细胞，B为激活后T细胞；图3为三种慢病毒共转导后的转导阳性率图；图4为共转导后细胞扩增倍数图；图5为CAR的示意图；具体实施方式为了进一步阐述本专利技术所用的技术手段，以下通过具体实施方式来进一步解释本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。本专利技术提供了一种将包括CAR在内的三种慢病毒同时转导入T细胞的改良嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括纯化T细胞的获取、IL-7及IL-15及CAR三种慢病毒的制备、共转导嵌合抗原受体T细胞的获取、改良CAR-T细胞的特性检测。实施例1纯化T细胞的获取用EDTA抗凝管取健康人的外周血，然后加入等体积的DPBS进行稀释。之后以稀释后的外周血与淋巴细胞分离液体积比为3:2的比例，加入淋巴细胞分离液，400g离心40min；从上至下细胞可分为4层，吸取第二层的白膜层，经DPBS洗涤后即可获得外周血单个核细胞，然后依据美天旎的PanTCellIsolationKit说明书操作即可获取纯化的T细胞。将纯化的T细胞计数后利用完全培养基调整细胞浓度为100万/mL，根据磁珠与细胞比为1:1～本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：在T细胞在病毒转导过程中，将含有IL‑7、IL‑15和 CAR三种慢病毒同时转导入T细胞。
【技术特征摘要】
1.一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：在T细胞在病毒转导过程中，将含有IL-7、IL-15和CAR三种慢病毒同时转导入T细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的方法由如下步骤实现：（1）采集健康人外周血，经密度梯度分离获得外周血单个核细胞，分选后获得纯化的T细胞；（2）T细胞激活后，取出IL-7、IL-15和CAR三种慢病毒进行离心共转导，随即吸弃病毒上清，更换培养液继续培养；（3）将步骤（2）转导后的T细胞进行流式分析，培养后即得到改良的嵌合抗原受体T细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的分选方法采用磁珠阴性分...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志杰，聂文冰，刘永军，尹鸿萍，
申请(专利权)人：江苏艾洛特医药研究院有限公司，江苏艾洛特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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