生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种构建重组谷氨酸棒杆菌生产新型靛蓝染料的方法，属于生物工程领域。通过将靛蓝合成酶基因(bpsA)及4’‑磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因(sfp)克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC 13032‑(BpsA‑SFP)，该重组谷氨酸棒杆菌能以L‑谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。摇瓶发酵培养LBG液体培养基中，温度为30℃，发酵培养至菌体生长OD600达到0.6‑0.8时，加入0.8mM IPTG及L‑谷氨酰胺11.68g/L，18℃，继续培养48h，靛蓝色素indigoidine产量最高，达到1.75g/L。本发明专利技术采用生物工程的策略，构建的重组谷氨酸棒杆菌来合成目的产物靛蓝色素indigoidine，为生物法高产indigoidine提供了新的思路。

Production of Corynebacterium glutamicum with indigo dye and its construction method and Application

The invention relates to a method for constructing recombinant Corynebacterium glutamicum to produce a new indigo dye, belonging to the field of bioengineering. The recombinant Corynebacterium glutamicum C. glutamicum ATCC 13032 (BpsA SFP) was constructed by cloning and recombining the indigo synthetase gene (bpsA) and 4'phosphopantothenyl thioethylaminotransferase gene (sfp) into Corynebacterium glutamicum. The recombinant Corynebacterium glutamicum can synthesize indigo dye with L glutamine as substrate. In shaking flask culture of LBG liquid medium, the temperature was 30 C, and the yield of indigoidine reached 1.75g/L when OD600 reached 0.6 0.8, adding 0.8mM IPTG and L glutamine 11.68g/L, 18 C, and culturing for 48h. The invention adopts the strategy of bioengineering to construct recombinant Corynebacterium glutamicum to synthesize the target product indigoidine, which provides a new idea for high-yield indigoidine by biological method.

【技术实现步骤摘要】
生产新型靛蓝染料谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及生产靛蓝重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
染料是人类工业生产和生活中必不可少的重要物质之一。我国是世界染料生产大国，常年生产量约占世界70％以上。据国家统计局统计数据显示，2015年我国染料销售额达到830亿元，预计2018年将超过千亿。工业染料大部分都是有机合成，成分中含有硫化氢、碱性物质和酸性物质等。传统染料生产工业产生的高盐废水和废酸是环境污染的重要源头之一。随着我国环境保护力度的加大，染料生产行业也面临着巨大的产业升级与淘汰压力。微生物发酵生产染料相对化学合成生产有着设备简单、条件吻合、污染少等众多优势。所以发展高效的微生物发酵生产染料核心技术是未来染料生产行业发展的出路之一。目前，食品级的色素大多数以红色、黄色为主，而对于蓝色素，相对稀缺。可作为食品级的蓝色素有栀子蓝色素、藻蓝蛋白和靛蓝，其中靛蓝有天然的和人工合成的，实际应用的主要是人工合成的靛蓝。新型靛蓝染料(indigoidine)是一种来自细菌的天然色素。天然色素具有安全、营养、保健等优点，而人工合成的色素在合成的过程中，容易受到重金属等有毒化学物质的污染，也会对人体造成伤害。消费者对人工合成色素存在疑虑，越来越青睐添加天然色素的食品。因此，通过基因工程、酶工程等手段，改造微生物来生产天然色素得到众多研究者的关注。Indigoidine是由非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomalpeptidesynthase,NRPS)催化两分子L-谷氨酰胺缩合而成。目前已经有关于靛蓝合成酶的报道，比如IndC(Erwiniachrysanthemi和StreptomycesaureofaciensCCM3239)、BpsA(Streptomyceslavendulae)和Sc-IdnC(Streptomyceschromofuscus)。这些靛蓝合成酶的氨基酸序列同源性高，基本构造一致，都含有C(缩合)-A(腺苷酰化)-Ox(氧化)-T(巯基化)-TE(巯基水解)四个结构域。靛蓝合成酶需要一个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)将辅酶A上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移到巯基化结构域保守的丝氨酸残基上，使之活化。张等利用靛蓝合成酶Sc-IdnC在大肠杆菌的细胞中表达生产Indigoidine。值得注意的是，大肠杆菌在生产食品等相关物质中受到限制，同时大肠杆菌不是Indigoidine的生物合成原料谷氨酰胺的高效生产菌株，使得Indigoidine后期产量的提高遇到瓶颈。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了以谷氨酰胺为原料开发靛蓝染料的新型生产菌株和方法。通过将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因通过克隆重组，共表达至谷氨酸棒杆菌中，构建重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌能以L-谷氨酰胺为底物合成靛蓝染料。本专利技术的第一个目的是提供一种生产靛蓝的重组谷氨酸棒杆菌，其通过共表达靛蓝合成酶及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，进而合成靛蓝染料。所述共表达，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体上进行表达。优选地，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子下进行表达。在本专利技术的一个具体实施方式中，是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于pEC-XK99E载体Ptrc启动子下进行表达。示例性地，所述靛蓝合成酶来源于以下任意一种：Streptomyceslavendulae来源的靛蓝合成酶BpsA、Erwiniachrysanthemi和StreptomycesaureofaciensCCM3239来源的靛蓝合成酶IndC、Streptomyceschromofuscus来源的靛蓝合成酶Sc-IndC。优选地，所述靛蓝合成酶来源于Streptomyceslavendulae。示例性地，所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Bacillussubtilis。在本专利技术的一个具体实施方式中，靛蓝合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在NCBI上登录号为ACG68433，其氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。本专利技术的第二个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其包括如下步骤：将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体，再转化到谷氨酸棒杆菌中，得到重组谷氨酸棒杆菌。示例性地，在靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶之间添加SD序列再将该序列置于同一载体同一启动子，转化到谷氨酸棒杆菌中，得到重组谷氨酸棒杆菌。其中，所述SD序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述载体为pEC-XK99E，所述启动子为Ptrc在本专利技术的一个具体实施方式中，重组谷氨酸棒杆菌的构建具体如下：以来源于Streptomyceslavendulae的基因组为模板扩增靛蓝合成酶基因bpsA，以来源于Bacillussubtilis的基因组为模板扩增4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp，设计引物时在4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp上游扩增引物中引入SD序列，并且在靛蓝合成酶基因bpsA、4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因sfp及pEC-XK99E载体的扩增引物中添加同源重组序列20bp，按照顺序克隆到载体pEC-XK99E上，筛选获得正确的重组质粒，命名为pEC-XK99E-BpsA-SFP，将重组质粒转化到宿主谷氨酸棒杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)当中即得到C.glutamicumATCC13032-(BpsA-SFP)；本专利技术的第三个目的是提供一种利用所述重组谷氨酸棒杆菌在生产靛蓝染料中的应用。本专利技术的第四个目的是提供利用所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产靛蓝染料的方法，所述方法是以L-谷氨酰胺为底物催化合成靛蓝染料。示例性地，所述方法包括以下步骤：采用摇瓶发酵，将重组谷氨酸棒杆菌种子液以1％的接种量接种到发酵培养基中，18℃-30℃，180-220rpm培养48-72h。在本专利技术的一个具体实施方式中，具体步骤是，从保存有重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC13032-(BpsA-SFP)的固体培养基上挑取单菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基当中，30℃，200rpm培养16h，即得到重组菌C.glutamicumATCC13032-(BpsA-SFP)的种子培养液；所述的固体培养中各组分用量占固体培养基质量用量的百分比分别是：胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl1％；葡萄糖0.5％；琼脂2％；pH7.0。所述LBG培养基中各组分用量占LBG培养基质量用量的百分比分别为胰蛋白胨1％；酵母提取物0.5％；NaCl1％；葡萄糖0.5％；pH7.0。摇瓶发酵培养时，将种子培养液按1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的LBG液体培养基中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌共表达靛蓝合成酶及4’‑磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。

【技术特征摘要】
1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌共表达靛蓝合成酶及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述共表达是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子或者同一载体不同启动子或者分别克隆到两个载体上进行表达。3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述共表达是将靛蓝合成酶基因及4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因置于同一载体同一启动子下表达；优选地，所述载体为pEC-XK99E，所述启动子为Ptrc。4.根据权利要求1-3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述靛蓝合成酶基因来源于Streptomyceslavendulae或Erwiniachrysanthemi或StreptomycesaureofaciensCCM3239或Streptomyceschromofuscus，优选地，所述靛蓝合成酶来源于Streptomyceslavendulae；所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Bacillussubtilis。5.根据权利要求1-5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述靛蓝合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；所述4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，核苷酸序列如SEQIDNO....

【专利技术属性】
技术研发人员：王猛，徐捷，刘扬，程海娇，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12