本发明专利技术公开了一种血管内皮生长因子检测试剂盒及检测方法，本发明专利技术的试剂盒包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒、生物素标记的VEGF抗体、化学发光标记物标记的VEGF抗体、VEGF标准品、化学发光预激发液、化学发光激发液、清洗液。采用该试剂盒进行检测，灵敏度高、反应时间短、操作简单，具有良好的应用前景。
A Kit for Detecting Vascular Endothelial Growth Factor and Its Detection Method
The invention discloses a detection kit for vascular endothelial growth factor and a detection method. The kit comprises streptavidin-coupled magnetic particles, biotin-labeled anti-VEGF antibody, chemiluminescent marker-labeled anti-VEGF antibody, vascular endothelial growth factor standard, chemiluminescent pre-excitation liquid, chemiluminescent excitation liquid and cleaning liquid. The kit has high sensitivity, short reaction time, simple operation and good application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种血管内皮生长因子的检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种蛋白免疫检测方法，关于一种基于电化学发光原理用于血管内皮生长因子(VEGF)检测的试剂盒及方法。
技术介绍
肿瘤细胞的生长、转移依赖新生血管的形成，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是最有效的促血管生长因子(Ferraraetal.Endocr.Rev.1997，18：4-25)。血管内皮生长因子是近些年研究较为广泛的一种全新广谱肿瘤标记物(Cancerbiomarker)，被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。根据本公司的研究成果和国外的文献报道血管内皮生长因子检测试剂盒有四大功能：VEGF血液学检测可作为(1)肿瘤的筛查、(2)肿瘤的辅助诊断(KondoS，BiochimBiophysActa.1994Mar31；1221(2)：211-4)、(3)肿瘤治疗疗效的评估和监测、(4)肿瘤预后、以及复发的监测(MarpgDClinCancerResApril2，2013；DOI：10.1158/1078-0432.CCR-12-3409)。VEGF相对分子量为45kDa，是由二硫键连接的糖蛋白二聚体，由同一N端而其他区域有某些差异的两条多肽链组成。VEGF基因位于染色体6p21.3，该基因经过转录水平的剪切，可产生5种不同的转录子，分别编码23，121，165，186和206个氨基酸多肽，VEGF是一种典型的外分泌蛋白。VEGF分解的单体无活性，去除N2糖基对生物效应无影响，但可能在细胞分泌中起作用。血管内皮细胞生长因子基因由8个外显子和7个内含子组成，定位于染色体6p21.3，由于外显子剪切的不同而形成不同的亚型，产生出分别VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，在人类中表达，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法、和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。中国专利201510115025.0公开了一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其原料制备，公开了以链霉亲和素包被，加入生物素化的VEGF单抗，与标本中抗原反应后形成亲和素-抗体-抗原复合物，再加入另一株HRP酶标记的VEGF单抗，最终形成亲和素-生物素化抗体-抗原-HRP标记抗体复合物。不过采用该方法实现的检测发光强度不够高，影响检测效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血管内皮生长因子检测试剂盒及检测方法，发光强度高、操作简单，具有良好的应用前景。一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒、生物素标记的VEGF抗体、化学发光标记物标记的VEGF抗体、VEGF标准品、化学发光预激发液、化学发光激发液、清洗液。优选地，所述化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物，所述吖啶酯衍生物包括吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸钠盐或9-吖啶羧酸。优选地，所述化学发光预激发液为含有质量百分比0.1-1％的乙醇以及质量百分比0.1-1％的TritonX-100和/或Tween-20的质量分数为0.1-1％的H2O2溶液，所述化学发光激发液为含有质量百分比0.1-1％的乙醇以及质量百分比0.1-1％的TritonX-100和/或Tween-20的摩尔浓度为0.05-1mol/L的NaOH溶液。优选地，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒由pH为6-8、摩尔浓度为0.01-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液配制而成，粒径为0.05-2μm。更优选地，所述磁性微粒内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁性微粒的表面修饰基团为羧基。优选地，所述VEGF标准品是以牛血清白蛋白缓冲液为溶剂，加入VEGF抗原纯品(优选纯度不低于90％)配制而成。更优选地，所述的VEGF标准品是配成的具有多个浓度梯度的VEGF标准品。优选地，所述清洗液包括质量百分比0.5-10％的TritonX-100和/或Tween20，pH为6-8、摩尔浓度为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，质量百分比0.5-5％的Proclin300。本专利技术还提供了采用上述试剂盒的检测方法，包括：(1)取生物素标记的VEGF抗体、待检测样品、化学发光标记物标记的VEGF抗体于反应容器中，充分混匀，并于37℃孵育10～30min，同时准备标准品；(2)向反应体系中加入链霉亲和素偶联的磁性微粒，充分混匀，并于37℃孵育3～10min，后清洗分离磁性微粒；向磁性微粒中加入化学发光预激发液和化学发光激发液的混合溶液，反应并测定光强度；(3)根据标准品浓度与光强度绘制标准曲线，样本光强度在标准曲线上相对应的浓度值即为待测样品的测定浓度。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术选用磁性微粒作为反应载体，利用电化学发光的检测体系，不仅提供了一种接近均相的反应体系，而且克服现有的酶联免疫法的技术缺陷。(2)本专利技术选择吖啶酯或其衍生物作为标记物，反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低。(3)本专利技术在化学发光预激发液和化学发光激发液中均添加乙醇作为稳定剂，添加TritonX-100或Tween-20作为增强剂，可以有效的增强吖啶酯或其衍生物的发光强度，同时还能减少发光系统出现气泡的机会；本专利技术还在清洗液中增加了Proclin300防腐剂，可利于进一步维护电极。(4)本专利技术通过全自动化的电化学发光免疫检测系统实现，试剂及样本的添加均由仪器完成，操作更加简便，减少人为的误差。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本专利技术，并非对本专利技术的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本专利技术的保护范围局限于此。以下实施例中使用的试剂，如非特殊说明，均可从市面上购得。实施例本专利技术主要包括以下步骤：(一)单克隆抗体的制备1、VEGF165融合蛋白的表达与纯化1)VEGF基因克隆和原核表达质粒的构建：从人胎盘cDNA文库中选取人VEGF165全长序列pGEX-4T-1作为载体，该载体含有谷胱苷肽S转移酶标签，蛋白的表达由tac启动子控制。tac启动子由IPTG诱导。克隆位点选取EcoRI和NotI。2)VEGF融合蛋白表达：将pGEX-4T-1/VEGF165转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞(大肠杆菌)，得到稳定和高效表达菌株。LB培养基培养，37℃表达GST-VEGF165融合蛋白包涵体。3)VEGF165融合蛋白纯化：工程菌培养于LB液体培养基，经IPTG诱导，表达2小时后，收集菌体，超声破碎后，加入Sarkosyl，混匀。将含融合蛋白上清加入GlpgtathioneSepharose4B凝胶，漂洗后，加入还原型谷胱甘肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒、生物素标记的VEGF抗体、化学发光标记物标记的VEGF抗体、VEGF标准品、化学发光预激发液、化学发光激发液、清洗液。
【技术特征摘要】
1.一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒、生物素标记的VEGF抗体、化学发光标记物标记的VEGF抗体、VEGF标准品、化学发光预激发液、化学发光激发液、清洗液。2.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物，所述吖啶酯衍生物包括吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸钠盐或9-吖啶羧酸。3.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液为含有质量百分比为0.1-1％的乙醇以及质量百分比0.1-1％的TritonX-100和/或Tween-20的质量分数为0.1-1％的H2O2溶液，所述化学发光激发液为含有质量百分比0.1-1％的乙醇以及质量百分比0.1-1％的TritonX-100和/或Tween-20的摩尔浓度为0.05-lmol/L的NaOH溶液。4.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒由pH为6-8、摩尔浓度为0.01-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液配制而成，粒径为0.05-2μm。5.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，其特征在于，所述磁性微粒内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁性微粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉庆，
申请(专利权)人：张嘉庆，
类型：发明
国别省市：北京,11
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