含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，属于中药制剂检测技术领域。所述测定方法包括：(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。本发明专利技术采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液作为含酚酸类化合物的中药注射液的稀释剂制备液相色谱分析的供试品溶液，解决了因酚酸类化合物对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰而无法准确测定的问题。

Determination of High Molecular Weight Substances in Traditional Chinese Medicine Injection Containing Phenolic Acids

The invention discloses a method for determining high molecular weight substances in Chinese medicine injection containing phenolic acids, which belongs to the technical field of Chinese medicine preparation detection. The determination methods include: (1) ultrafiltration and concentration of the Chinese medicine injection to be tested, dilution and volume determination of the sample solution by using methanol aqueous solution containing trifluoroacetic acid or acetonitrile aqueous solution containing trifluoroacetic acid, and preparation of the sample solution; (2) liquid chromatography analysis of the sample solution, recording the chromatogram, and comparing the chromatographic peaks of the standard protein molecular weight substance under the same chromatographic conditions, and regression according to the peak area. The proportion of high molecular weight substances with molecular weight greater than 5000 Dalton was calculated by the unification method. The present invention uses methanol aqueous solution containing trifluoroacetic acid or acetonitrile aqueous solution containing trifluoroacetic acid as diluent of traditional Chinese medicine injection containing phenolic acid compound to prepare test solution for liquid chromatography analysis, and solves the problem that phenolic acid compound can not be accurately determined because of interference of polypeptide or protein high molecular weight substance detection.

【技术实现步骤摘要】
含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法
本专利技术涉及中药制剂检测
，具体涉及一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法。
技术介绍
中药注射剂作为中华民族传统文化的代表，在人类健康史上发挥着不可替代的作用。中药注射液系指饮片经提取、纯化后制成的供注入人体内的无菌液体制剂，包括溶液型或乳状液型或混悬型等注射液，但随着应用的增多，有关临床不良反应的报道相继增加，尤其是严重的不良反应如过敏性休克、心血管系统不良反应、呼吸系统损伤等。有学者认为中药注射液中蛋白质或多肽高分子物质的存在极有可能是引起不良反应的因素之一，在药剂提取过程中存在部分高分子物质，如蛋白质、多肽等，此类物质一旦引入中药注射剂成品，将引起中药注射剂的一系列不良反应或不良事件。因此，亟需建立中药注射剂中高分子量物质的检测方法，用于其高分子量物质的控制。现有的中药注射剂的高分子量物质的检测方法基本上是采用葡聚糖凝胶色谱柱HPLC法分析，采用已知分子量的标准物质定位，判断高分子是否存在或者用于标定分子量的分布区间。目前研究者常通过高效液相体分子排阻色谱法直接分析样品(中医药学报，2013，41，31–32；中国药学杂志，2014，49，64–67；中国药业，2014，23，51–52)或采用超滤的方法将样品富集后进行分析(中国药品标准，2012，13，1；药物分析杂志，2016，36，1451–1455)。据文献报道，中药注射剂中含有的酚酸类化合物能够通过疏水作用和氢键等相互作用与蛋白质或多肽结合(JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis，2017，134，100–107；PlosOne，2015，10，e0128919)。而上述常见的测定高分子量物质的方法中溶剂均为水，无法消除酚酸类化合物与蛋白质或多肽的相互作用，进而影响蛋白质或多肽等高分子量物质在凝胶柱中的保留时间和紫外响应，使得无法准确测定。因此，为了消除样品中酚酸类化合物对蛋白质或多肽等高分子量物质测定的影响，必须研究建立消除酚酸类化合物干扰的特异样品预处理方法，以保证有效、准确地测定含酚酸类成分的中药注射剂中高分子量物质，对含酚酸类成分的中药注射剂中蛋白质或多肽类高分子量物质的监测，保障用药安全，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可有效消除样品中的酚酸类化合物对蛋白质或多肽等高分子量物质检测结果影响的供试品制备方法，提高含酚酸类成分的中药注射液中蛋白质或多肽等高分子量物质检测准确度。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，包括以下步骤：(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，如供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收峰，则判定待测中药注射液中含有多肽或蛋白类高分子量物质，或者按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。本专利技术研究表明，在制备供试品溶液时，采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或乙腈水溶液作为稀释剂，能有效消除酚酸类物质对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰，保证样品中高分子量物质测定的准确性，为中药注射液的安全性提供有效的评估数据。临床上使用的含酚酸类成分的中药注射液有丹红注射液、刺五加注射液、丹参注射液等。作为优选，步骤(1)中，采用截留分子量为3000Da的超滤离心管进行超滤浓缩，离心力为1000-4000g。本专利技术将待测中药注射液经超滤浓缩5-10倍，有助于提高检测灵敏度。具体地，取5～20.0mL待测中药注射液超滤离心至0.2～0.5mL，再利用稀释剂定容至2mL。更为优选，离心力采用2800g。超滤浓缩后，采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或乙腈水溶液吹打超滤内衬管中富集的注射液并定量转移至2.0ml量瓶中，制成供试品溶液。研究表明，供试品溶液中三氟乙酸终浓度为0.13％-0.15％，甲醇终浓度为45％-55％或乙腈终浓度为17％-20％时，能够有效消除酚酸类物质对多肽或蛋白质类高分子量物质检测的干扰。作为优选，步骤(1)中，所述的含三氟乙酸的甲醇水溶液中三氟乙酸体积百分比为0.15％-0.25％、甲醇的体积百分比为55％-60％；所述的含三氟乙酸的乙腈水溶液中三氟乙酸的体积百分比为0.05％-0.25％、乙腈的体积百分比为15％-20％。作为优选，浓缩液与含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液按照体积比1:6-8进行混合。供试品溶液在液相色谱分析之前，经8000-15000rpm离心5-15分钟，取上清液进行分析。步骤(2)中，采用TSKgelG2000SWXL凝胶柱(7.8×300mm，5μm)进行液相色谱分析。该类凝胶柱主要用于分析多肽或蛋白质，对色谱条件进行优化得出适合本专利技术制备的供试品溶液分析方法。作为优选，色谱条件为：0.05％三氟乙酸乙腈与0.05％三氟乙酸溶液以体积比30:70混合的混合液为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，检测波长为214nm，进样量100μL。作为优选，步骤(2)中，所述的标准蛋白分子量物质为分子量为13700Da的核糖核酸酶A、分子量为5808Da的人胰岛素、分子量为3108Da的胸腺肽α1和分子量为1638Da的生长抑素。可采用上述标准蛋白分子量物质的混合物作为对照，具体地，分别取核糖核酸酶A(分子量13700)、人胰岛素(分子量5808)、胸腺肽α1(分子量3108)和生长抑素(分子量1638)对照品各1支，加10％乙腈水溶液(含0.05％三氟乙酸)溶解并稀释制成每1ml中各含1mg的储备液。分别精密量取各分子量对照储备液适量，加含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容制成混合分子量对照溶液。以混合分子量对照品各峰的保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标，进行线性回归，供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收的判定为待测中药注射液中有多肽或蛋白类高分子质量物质。按面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比或分子量分布。具体地，将比人胰岛素色谱峰先出峰的色谱峰视为高分子物质。本专利技术具备的有益效果：(1)本专利技术采用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液作为含酚酸类化合物的中药注射液的稀释剂制备液相色谱分析的供试品溶液，能够解决因酚酸类化合物对多肽或蛋白质类高分子量物质的干扰导致的高分子量物质液相色谱保留时间发生变化而无法准确判断是否含有高分子量物质的问题。(2)本专利技术通过优化制样条件和色谱条件，显著提高了高分子量物质检测的准确性，可应用于生物医药领域注射剂的研发、生产工艺科学性与合理性的评价。附图说明图1为丹红供试品溶液中甲醇终浓度对高分子量物质人胰岛素(A)和核糖核酸酶A(B)测定回收率的影响。图2为丹红供试品溶液中三氟乙酸终浓度对高分子量物质测定回收率的影响。图3为样品采用超滤管富集后洗涤次数优化。图4为刺五加供试品溶液中乙腈终浓度对高分子量物质测定回收率的影响。图5为刺五加供试品溶液中三氟乙酸终浓度对高分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，如供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收峰，则判定待测中药注射液中含有多肽或蛋白类高分子量物质，或者按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。

【技术特征摘要】
1.一种含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测中药注射液超滤浓缩，利用含三氟乙酸的甲醇水溶液或含三氟乙酸的乙腈水溶液稀释并定容，制得供试品溶液；(2)取供试品溶液进行液相色谱分析，记录色谱图，以相同色谱条件下的标准蛋白分子量物质的色谱峰作为对照，如供试品色谱中分子量为5000道尔顿的保留时间前有吸收峰，则判定待测中药注射液中含有多肽或蛋白类高分子量物质，或者按峰面积归一化法计算分子量大于5000道尔顿的高分子量物质的占比。2.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，采用截留分子量为3000Da的超滤离心管进行超滤浓缩，离心力为1000-4000g。3.如权利要求1所述的含酚酸类成分的中药注射液中高分子量物质的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含三氟乙酸的甲醇水溶液中三氟乙酸体积百分比为0.15％-0.25％、甲醇的体积百分比为55％-60％；所述的含三氟乙酸的乙腈水溶液中三氟乙酸的体积百...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，邵青，王娇娇，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33