一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞，包括Mesothelin抗原受体和NY‑ESO‑1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY‑ESO‑1抗原受体为基因修饰抗原受体，其中Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，NY‑ESO‑1抗原受体的编码基因序列为SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法和应用。本发明专利技术提供的双靶点特异性T淋巴细胞可以适用于两个肿瘤靶点，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱。

A Double Target Specific T Lymphocyte and Its Preparation and Application

The present invention provides a dual target specific T lymphocyte, including Mesothelin antigen receptor and NY_ESO_1 antigen receptor. The Mesothelin antigen receptor is a chimeric antigen receptor. The NY_ESO_1 antigen receptor is a gene modified antigen receptor. The coding gene sequence of Mesothelin antigen receptor is shown in SEQ ID NO:1, and the coding gene sequence of NY_ESO_1 antigen receptor is shown in SEQ ID NO:1. As shown in SEQ ID NO:2. The invention also provides a preparation method and application of double target specific T lymphocyte. The double target specific T lymphocyte provided by the invention can be applied to two tumor targets, enhance the recognition of cancer cells, avoid target escape of cancer cells, and expand the killing spectrum of immune cells.

【技术实现步骤摘要】
一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学生物领域，特别涉及一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
免疫细胞治疗是现有科技中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法，其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并在白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤中取得了卓越的临床疗效，被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的一种治疗手段。嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)以及基因修饰的T细胞受体技术(TCR)作为当前过继性细胞回输治疗技术两大最新的免疫细胞技术，因其能够在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶性肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究。CAR-T和TCR-T原理相似，其中，CAR-T的肿瘤识别蛋白为人工设计，因此可以不依赖于主要组织相容性复合体等人体正常免疫识别体系，但是无法识别表达在肿瘤内部的靶点，在实体瘤方面的疗效还十分有限；而TCR-T的肿瘤识别模式是通过改造T细胞本身的T细胞受体，增强其对肿瘤的亲和力，比CAR-T更加“天然，”但其单独使用，在肿瘤杀伤能力方面也很有限，特别是对于多种肿瘤抗原同时出现的情况，在复杂的肿瘤微环境中，其杀伤肿瘤细胞的能力被大大降低，限制了其临床应用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞及其制备方法和应用。本专利技术提供的双靶点特异性T淋巴细胞可以适用于两个肿瘤靶点，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱。第一方面，本专利技术提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞，包括Mesothelin抗原受体和NY-ESO-1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY-ESO-1抗原受体为基因修饰抗原受体，所述Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQIDNO：1所示，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因序列为SEQIDNO：2所示。其中所述Mesothelin抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。其中所述NY-ESO-1抗原受体的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示。具体地，所述Mesothelin抗原受体的编码基因包括Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。具体地，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因包括NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。第二方面，本专利技术提供了一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2所示的DNA分子。可选地，所述重组慢病毒载体包含核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的DNA分子。采用重组慢病毒载体感染T淋巴细胞，可得到如本专利技术第一方面所述的双靶点特异性T淋巴细胞。可选地，重组慢病毒载体分别包含核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的DNA分子、如SEQIDNO：2所示的DNA分子，采用这两种重组慢病毒载体共同感染T淋巴细胞，也可得到如本专利技术第一方面所述的双靶点特异性T淋巴细胞。第三方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的重组慢病毒载体。第四方面，本专利技术提供了一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，包括：(1)构建pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒，通过氨基端到羧基端顺次拼接人信号肽、靶向Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区、CD3ζ胞内信号区构成CAR-Mesothelin序列，所述CAR-Mesothelin序列如SEQIDNO:1所示，并连接pWPXLD载体；(2)构建pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，通过氨基端到羧基端顺次拼接人信号肽、靶向NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区、CD3ζ胞内信号区构成TCR-NY-ESO-1序列，所述TCR-NY-ESO-1序列如SEQIDNO:2所示，并连接pWPXLD载体；(3)包装所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，得到重组慢病毒；(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞；(5)分离并获取所述双靶点特异性T淋巴细胞。具体地，所述包装所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒，得到重组慢病毒，包括如下步骤：将所述pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒和所述pWPXLD-TCR-NY-ESO-1重组质粒分别与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，完成所述重组慢病毒的构建。可选地，所述包膜质粒为pMD2.G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为293T细胞。可选地，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。可选地，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。具体地，在步骤(4)之前先将外周血单个核细胞按一定比例加入CD3磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行分离得到CD3阳性T淋巴细胞。第五方面，本专利技术提供了一种如第一方面所述的细胞、如第二方面所述的重组慢病毒载体、如第三方面所述的宿主细胞、如第四方面所述的制备方法制备方法制得的双靶点特异性T淋巴细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。尤其在胰腺癌中的应用。本专利技术的效益：(1)同时靶向两个肿瘤靶点(Mesothelin以及NY-ESO-1)，增强了对癌细胞的识别，避免癌细胞出现靶点逃逸，扩大了免疫细胞的杀伤谱；(2)免疫细胞同时具备嵌合抗原受体以及T细胞受体两种识别模式，提升了肿瘤杀伤能力，高效多样化的识别癌症细胞，对于复杂的肿瘤微环境有着更强的肿瘤杀伤能力；(3)节约免疫细胞治疗成本，降低所需的CAR-T细胞总数，极大节省其中的人力、物力和财力，减少患者治疗疗程，减轻患者治疗费用负担。附图说明图1为本专利技术实施提供的pWPXLd-CAR-Mesothelin重组载体的质粒图谱。图2为本专利技术实施提供的pWPXLd-TCR-NY-ESO-1重组载体的质粒图谱。图3为本专利技术实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性率；图3(A)为阴性对照组，图3(B)为本专利技术实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞的阳性组。图4为本专利技术实施例提供的CD3+/CD8+阳性细胞情况；图4(A)为阴性对照组，图4(B)为采用本专利技术所述方法后CD3+/CD8+阳性细胞情况。图5为本专利技术实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞体外肿瘤杀伤效果。图6为本专利技术实施例提供的双靶点特异性T淋巴细胞治疗肿瘤小鼠的效果。具体实施方式以下所述是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本专利技术的保护范围。下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，实施例一、一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，包括Mesothelin抗原受体和NY‑ESO‑1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY‑ESO‑1抗原受体为基因修饰抗原受体，所述Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述NY‑ESO‑1抗原受体的编码基因序列为SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，包括Mesothelin抗原受体和NY-ESO-1抗原受体，所述Mesothelin抗原受体为嵌合抗原受体，所述NY-ESO-1抗原受体为基因修饰抗原受体，所述Mesothelin抗原受体的编码基因序列如SEQIDNO：1所示，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因序列为SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述Mesothelin抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。3.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述NY-ESO-1抗原受体的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示。4.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述Mesothelin抗原受体的编码基因包括Mesothelin单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。5.如权利要求1所述的双靶点特异性T淋巴细胞，其特征在于，所述NY-ESO-1抗原受体的编码基因包括NY-ESO-1单链抗体、CD8α铰链区、CD8TM区、4-1BB信号区和CD3ζ胞内信号区基因片段。6.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和/或SEQIDNO：2所示的DNA分子。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求6所述的重组慢病毒载体。8.一种双靶点特异性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括：(1)构建pWPXLD-CAR-Mesothelin重组质粒，通过氨基端到羧基端顺...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏玲，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44