一种通过强化NADH脱氢增强甾药前体生产的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，具体涉及一种通过强化甾药生产菌株胞内NADH脱氢实现增强甾药前体生产的方法。本发明专利技术引入在甾药生产菌株属微生物体内存在的不具有质子泵功能的NADH脱氢酶‑NDH2，构建NDH2加强的甾药前体生产菌株，以加强甾药前体生产菌株内NADH的脱氢，解决甾药前体微生物转化生产过程中NADH过量积累而导致的发酵周期长、生产效率低的问题，有助于降低甾药前体生产过程中的能耗以节约生产成本。该方法可有效用于其他工业生产菌株胞内NADH脱氢的加强，具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。

A Method of Enhancing the Production of Steroid Precursors by Enhancing NADH Dehydrogenation

The invention belongs to the field of biocatalysis technology, in particular to a method for enhancing the production of steroid precursors by enhancing the intracellular NADH dehydrogenation of steroid producing strains. The present invention introduces NADH dehydrogenase NDH2 which does not have proton pump function in steroid producing strains, and constructs NDH2-enhanced steroid precursor producing strains to enhance the dehydrogenation of NADH in steroid precursor producing strains, to solve the problems of long fermentation period and low production efficiency caused by excessive accumulation of NADH in steroid precursor microbial transformation production process, and to help reduce the production efficiency. The energy consumption in the production of steroid precursors can save production cost. This method can be effectively used to enhance the intracellular NADH dehydrogenation of other industrial strains, and has wide application value. It provides a new method for reducing the production cost of steroid precursors.

【技术实现步骤摘要】
一种通过强化NADH脱氢增强甾药前体生产的方法
：本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种通过强化甾药生产菌株胞内NADH脱氢实现增强甾药前体生产的方法。
技术介绍
：甾体药物是制药工业中主要销售的产品并在临床上被广泛用。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(AD)，1,4-雄甾烯-3,17-二酮(ADD)和9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-羟基雄烯二酮)是合成甾药的重要前体。AD和ADD是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。9α-羟基雄烯二酮是生产9α位上有卤素的甾体药物的重要前体，利用9α-羟基雄烯二酮可以合成氢化可的松、17α-羟基黄体酮、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟轻松、氟羟泼尼松龙等多种重要的甾体药物。细菌、放线菌、真菌都能够用来对甾体底物进行9α-羟化，其中以含分枝菌酸的分枝杆菌属为主。作为化学合成的替代，反应条件温和、环境友好的微生物转化法已成为制药工业中生产甾体药物中间体的主要方法。另一方面，天然甾醇是微生物转化法可用的低成本原料。一般来说，植物甾醇的代谢途径在这些微生物中高度保守，主要涉及植物甾醇吸收，脂肪族侧链的降解和9α位的羟基化三个过程。针对植物甾醇母核氧化或侧链降解代谢途径中关键酶的操作可以增强甾药前体的生产。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的摩尔转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降。因此还需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。植物甾醇代谢途径中许多关键酶属于辅酶依赖型酶，辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比例的控制。Su等(SuLQ,ShenYB,ZhangWK,GaoT,ShangZH,WangM(2017)CofactorengineeringtoregulateNAD+/NADHratiowithitsapplicationtophytosterolsbiotransformation.MicrobCellFact16(1):182-192)的研究表明植物甾醇在转化过程中会抑制复合体I多亚基的转录表达，导致菌体内部NADH的过量积累。该研究还表明通过过表达NADH氧化酶促进胞内NAD+的再生，来促进AD(D)生产效率，但NADH氧化酶过表达后会造成ATP含量降低，导致菌体的生长受到明显的抑制，且NADH氧化酶表达活性越高，菌体受抑制程度越明显，使AD(D)的生产周期延长。因此，无论是甾药前体生产的原始菌株还是工程菌株均存在胞内NADH过量积累的问题。同时转化周期长(≥120小时)，且在转化中后期(72小时后)菌株的生产力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低也是甾药前体生产菌株的共性问题。这也是造成甾药前体生产成本高昂的主要原因之一。
技术实现思路
：为了解决上述技术问题，本专利技术引入在甾药生产菌株属微生物体内存在的另外一种不具有质子泵功能的NADH脱氢酶-NDH2，NDH2是50-60KD的单亚基酶，其具有NADH脱氢的功能。本专利技术将获取并利用NDH2，构建NDH2加强的甾药前体生产菌株，以加强甾药前体生产菌株内NADH的脱氢，解决甾药前体微生物转化生产过程中NADH过量积累而导致的发酵周期长、生产效率低、菌体活性低的问题，有助于降低甾药前体生产过程中的能耗以节约生产成本。该方法可有效用于其他工业生产菌株胞内NADH脱氢的加强，具有广泛的应用价值，为甾药前体生产成本的降低提供了新方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之一，是一株过表达NADH脱氢酶-NDH2的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主为具有甾药前体生产能力的细菌或真菌；所述的甾药前体，包括但并不限于雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，AD)、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(Androst-1,4-diene-3,17-dione，ADD)、A环降解物等；所述的NDH2为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列；所述的NDH2的编码基因与SEQIDNO:l所示序列的核苷酸序列具有60％以上的一致性；进一步地，所述的NDH2的编码基因为SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；SEQIDNO:l所示NDH2基因，来源于快速生长型偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)ARL-91,该菌株已于2018年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNO.16771；较佳的，所述的基因工程菌是利用基因工程表达载体，进行甾药前体生产菌株自身NDH2的过表达或在非自身菌株中的异源表达而构建的甾药前体生产基因工程菌，所述的基因工程表达载体整合有NDH2基因；较佳的，所述的基因工程表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体；优选的，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体或分枝杆菌表达载体；更优选地，所述的大肠杆菌表达载体是PET表达载体，所述的枯草芽孢杆菌表达载体是质粒pWB980，所述分枝杆菌表达载体是pMV306或PFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2或pMV261分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体；优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacteriumgilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)、草分枝杆菌(MycobacteriumPhlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)等；更优选地，所述宿主细胞为偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)ARL-91。本专利技术还提供上述基因工程菌在生产甾药前体中的应用，特别是在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用；在生产9α-羟基雄烯二酮中的应用具体如下：将基因工程菌种子培养液以2-10％的接种量转接于发酵培养基中，在25-35℃，50-200rpm条件下培养24-168h；9α-羟基雄烯二酮产量可以达到0.3-30g/L，摩尔转化率可以达到50％-99％；发酵培养基组成：K2HPO40.1-3g/L，MgSO40.1-3g/L，柠檬酸铁铵0.01-0.2g/L，柠檬酸1-5g/L，磷酸氢二铵1-10g/L，葡萄糖5-50g/L，植物甾醇1-50g/L，羟丙基β-环糊精10-30mM，其余为水，pH6.0-7.5。有益效果：本专利技术通过过表达Ⅱ型NADH脱氢酶-NDH2,使分枝杆菌胞内NADH的含量最高减少了29.5％，促进了胞内NAD+的再生，使胞内NAD+/NADH比例提高了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌通过在具有甾药前体生产能力的细菌或真菌宿主中过表达NADH脱氢酶‑NDH2获得；所述NDH2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

【技术特征摘要】
1.一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌通过在具有甾药前体生产能力的细菌或真菌宿主中过表达NADH脱氢酶-NDH2获得；所述NDH2为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。2.如权利要求1所述的一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述甾药前体，包括雄甾-4-烯-3,17-二酮、9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮和A环降解物。3.如权利要求1所述的一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述NDH2的编码基因与SEQIDNO:l所示序列的核苷酸序列具有60％以上的一致性。4.如如权利要求3所述的一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述NDH2的编码基因为SEQIDNO:l所示序列。5.如权利要求1所述的一种甾药前体生产基因工程菌株，其特征在于，所述基因工...

【专利技术属性】
技术研发人员：申雁冰，王敏，周秀玲，张扬，夏梦雷，骆健美，张晓，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12