一种小球藻原生质体制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于转基因小球藻原生质体的制备方法，包括如下步骤：(1)将小球藻细胞接种至活化培养基培养至对数生长期获得种子液后将种子液扩大培养，收集小球藻细胞；(2)利用200mM EDTA和250mM DTT预处理小球藻细胞；(3)将预处理后的小球藻细胞利用复合酶(2％纤维素酶、2％果胶酶和2％蜗牛酶)在30℃，pH 5.8，120rpm，酶解14h的条件下处理，可得到原生质体，原生质体底滤为49.17％。本发明专利技术利用化学试剂及复合酶处理小球藻，能够得到高转化效率的原生质体用于转基因小球藻的构建。

A METHOD FOR PREPARATION OF CHLOROCYLLA PROTOPLASTS

The invention provides a preparation method for protoplasts of genetically modified chlorella, which comprises the following steps: (1) inoculating Chlorella cells into an activated medium and culturing them in logarithmic growth phase to obtain seed solution, then expanding the culture of seed solution and collecting Chlorella cells; (2) pretreating Chlorella cells with 200 mM EDTA and 250 mM DTT; (3) utilizing composite enzymes to pretreat Chlorella cells; (2) utilizing pre-treated Chlorella cells. % When cellulase, 2% pectinase and 2% snail enzyme were treated at 30 C, pH 5.8, 120 rpm and 14 h of enzymatic hydrolysis, the protoplast could be obtained, and the protoplast bottom filtration rate was 49.17%. The invention uses chemical reagents and complex enzymes to treat chlorella, and can obtain protoplasts with high transformation efficiency for the construction of genetically modified chlorella.

【技术实现步骤摘要】
一种小球藻原生质体制备方法
本专利技术涉及一种小球藻原生质体制备方法，属于海洋生物

技术介绍
小球藻胞内富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和生长因子等物质，作为一种经济性微藻，已在日本、韩国、美国等国家被广泛用作健康食品添加剂、水产养殖饵料和医疗保健品。但是，小球藻自然资源的开发在一些研究和应用领域还是不能满足人类的需求，随着基因工程技术与手段的成熟与开发，利用基因工程手段对小球藻进行遗传重组改造以生产有用物质成为了目前重要的研究领域。小球藻结构简单，生长繁殖迅速，培养成本低，大规模的培养技术也有长久的历史研究。相对于微生物和植物，小球藻基因工程技术较晚。小球藻的细胞壁较厚且坚硬，成分也较复杂，根据文献报道小球藻细胞壁组成分别为：蛋白质含量约为27％，脂质含量约为9.2％，α-纤维素含量约为15.4％，半纤维素含量约为31％，葡萄糖铵含量约为3.3％,灰分约5.2％等，由于小球藻细胞壁结构复杂，存在大量纤维素，半纤维素等，导致转化困难且效率低，因此，寻求一种高效简便的小球藻原生质体制备方法,是对小球藻进行基因工程操作的基础。对小球藻进行基因工程改造首先要建立高效、稳定的转化方法。目前，应用于小球藻遗传转化的方法有电击转化法、基因枪法、玻璃珠法等方法，这些方法往往由于不明原因导致转化效率低的，死亡率高，原生质体转化法具有转化效率高的优点，但现存的方法往往由于不能很好的形成原生质体而导致后续的转化效率低。针对小球藻原生质体制备效率低的问题，有必要对小球藻原生质体制备方法和过程进行探索和优化，提高原生质体的形成率，进一步提高转化效率，为转基因小球藻提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种小球藻原生质体制备方法，以解决小球藻原生质体得率低的问题。本专利技术的技术方案如下：一种小球藻原生质体制备方法，包括如下步骤：1)预处理：利用EDTA(乙二胺四乙酸)、DTT(二硫苏糖醇)混合溶液处理小球藻细胞，其中，EDTA(乙二胺四乙酸)浓度为150-250mM，DTT(二硫苏糖醇)浓度200-300mM；预处理条件为25-30℃，25-35min，50-150rpm；2)预处理的细胞去除预处理液，然后采用纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶混合酶处理小球藻细胞，即得到高转化率的小球藻原生质体，其中，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的浓度均为1-3％；处理的条件为25-35℃，pH5-6，10-1500rpm，酶解时间为12-16h。在较佳实施例中，预处理剂用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。在较佳实施例中，预处理条件为28℃，30min，100rpm，离心去掉预处理剂后，用预冷0.2M的KCl洗涤3遍。在较佳实施例中，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的浓度均为2％，酶处理剂均用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。5在较佳实施例中，混合酶处理的条件为30℃，pH5.8，120rpm，酶解时间为14h。在较佳实施例中，酶解完成之后用0.2M山梨醇和0.2M甘露醇溶液洗涤3遍。在较佳实施例中，洗涤后用5000rpm，5min取得小球藻细胞，最后小球藻细胞用0.2M山梨醇和0.2M甘露醇溶液重悬得原生质体溶液。作为优选，本专利技术的技术方案为：一种小球藻原生质体制备方法，包括如下步骤：1)小球藻于50mLFC培养基中，30℃、180r/min摇床培养至对数期，3000rpm；离心10min收集藻体，用预冷无菌水洗涤3遍。2)离心去掉无菌水，用20mL预处理剂重悬，30℃摇床预处理30min。所述预处理剂为200mMEDTA(乙二胺四乙酸)和250mMDTT(二硫苏糖醇)；3)离心去掉预处理剂，用预冷0.2M的KCl洗涤3遍。4)加入10mL酶处理液，重悬，30℃摇床酶解14h。所述混合酶处理液包括纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶，混合液中每种酶浓度均为2％；5)离心去酶处理液，用0.2M山梨醇和0.2M甘露醇溶液洗涤3遍.6)并用0.2M山梨醇和0.2M甘露醇溶液重悬得原生质体溶液。与现有技术相比本专利技术的有益效果是：利用本方法制备的原生质体，得率高，进行转基因实验，最大限度的保证了小球藻的活性，从而提高了转基因小球藻的数目，具有较好的稳定性。本专利技术提供的一种小球藻原生质体制备方法，其制备工艺简单，设备要求较低，便于推广应用。附图说明图1：预处理时间对原生质体的影响图2：不同酶制剂处理对小球藻形成原生质体的影响图3：混合酶制剂处理时间对原生质体形成的影响图4：混合酶制剂处理温度对原生质体形成的影响。具体实施方式分别将3.7244gEDTA溶于50mL的20mM磷酸盐缓冲液中(pH5.8)，配成200mM的溶液，将0.3856gDTT溶于10mL的20mM磷酸盐缓冲液中(pH5.8)，配成250mM的溶液，将14.91g的KCl溶于20mmol/L的磷酸盐缓冲液中(pH5.8)，配成2mol/L的溶液。同时将1g纤维素酶溶解到10mL的20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)中配成10％溶液，将1g蜗牛酶溶解到10mL的20mM磷酸盐缓冲液中配成10％溶液；将1g果胶酶溶解到10mL的20mM磷酸盐缓冲液中，配成10％溶液。实施例1预处理：小球藻于50mLFC培养基中，30℃、180r/min摇床培养至对数期，3000rpm；离心10min收集藻体，用预冷无菌水洗涤3遍。离心去掉无菌水，用20mL预处理剂重悬，所述预处理剂为EDTA(乙二胺四乙酸)和DTT(二硫苏糖醇)混合液；预处理所用EDTA(乙二胺四乙酸)、DTT(二硫苏糖醇)浓度分别为200mM，250mM，预处理剂用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。处理条件为28℃，不同处理时间(0min-60min)，100rpm，离心去掉预处理剂后，用预冷0.2M的KCl洗涤3遍。其结果见图1。从图1中可见，预处理时间为30min的原生质体形成率最高。实施例2在本实施例中，选用经过实施例1预处理时间为30min的细胞。经过预处理的细胞，改用纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶处理。酶处理剂均用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。酶解时间为14h。处理分为2％纤维素酶、2％果胶酶、2％蜗牛酶、2％纤维素酶+2％蜗牛酶、2％纤维素酶+4％蜗牛酶、2％纤维素酶+2％蜗牛酶+2％果胶酶共6组。结果见图2。从图2中可见，2％纤维素酶+2％蜗牛酶+2％果胶酶组效果最佳。实施例3在本实施例中，选用经过实施例1预处理时间为30min的细胞。采用2％纤维素酶+2％蜗牛酶+2％果胶酶，混合酶处理的条件为不同温度25℃-37℃，pH5.8，120rpm，不同的酶解时间为8h-16h。其结果分别见图3和图4。从图3可见，处理时间14h最佳。处理温度为30度最佳。最佳实施例1)小球藻于50mLFC培养基中，30℃、180r/min摇床培养至对数期，3000rpm；离心10min收集藻体，用预冷无菌水洗涤3遍。2)离心去掉无菌水，用20mL预处理剂重悬，30℃摇床预处理30min。3)离心去掉预处理剂，用预冷0.2M的KCl洗涤3遍。4)加入10mL酶处理液(2％纤维素酶+2％蜗牛酶+2％果胶酶)，重悬，30℃摇床酶解14h。5)离心去酶处理液，用0.2M山梨醇和0.2M甘露醇溶液洗涤3遍.6)并用0.2M山梨醇和0.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小球藻原生质体制备方法，包括如下步骤：1)预处理：利用EDTA、DTT混合溶液处理小球藻细胞，其中，EDTA浓度为150‑250mM，DTT浓度200‑300mM；处理条件为25‑30℃，25‑35min，50‑150rpm；2)预处理的细胞去除预处理液，然后采用纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶混合酶处理小球藻细胞，即得到高转化率的小球藻原生质体，其中，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的浓度均为1‑3％；预处理的条件为25‑35℃，pH 5‑6，10‑1500rpm，酶解时间为12‑16h。

【技术特征摘要】
1.一种小球藻原生质体制备方法，包括如下步骤：1)预处理：利用EDTA、DTT混合溶液处理小球藻细胞，其中，EDTA浓度为150-250mM，DTT浓度200-300mM；处理条件为25-30℃，25-35min，50-150rpm；2)预处理的细胞去除预处理液，然后采用纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶混合酶处理小球藻细胞，即得到高转化率的小球藻原生质体，其中，纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的浓度均为1-3％；预处理的条件为25-35℃，pH5-6，10-1500rpm，酶解时间为12-16h。2.如权利要求1所述的小球藻原生质体制备方法，其特征在于：预处理剂用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。3.如权利要求1的小球藻原生质体制备方法，其特征在于：预处理条件为28℃，30min，100rpm，离心去掉预处理剂后，用预冷0.2M的KCl洗涤3遍。4.如权利要求1所述的一种小球藻原生质体制备方法，其特征在于：纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶的浓度均为2％，酶处理剂均用pH5.8、20mM的磷酸盐缓冲液溶解。5.如权利要求1所述的一种小球藻原生质体制备方法，其特征在于：混合酶处理的条...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昭凯，胡凡，吴丽娟，林祥志，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35