一种检测氟虫腈的试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测氟虫腈的试剂盒及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的氟虫腈检测试剂盒包括氟虫腈酶标板、氟虫腈标准品工作液、氟虫腈抗体工作液、酶标记物工作液、底物液、终止液，还包括式I所示的氟虫腈半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供的氟虫腈检测试剂盒，操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强，对于畜禽产品中氟虫腈残留快速检测具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测氟虫腈的试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测氟虫腈的试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
氟虫腈是一种苯基吡唑类杀虫剂、杀虫谱广，用于防治地面和地下害虫、茎叶处理和土壤处理、种子处理等。其作用机制在于阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢，因此对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性，是被众多农药专家推荐为代替高毒有机磷农药的首选品种之一，近年来，氟虫腈也广泛用于卫生杀虫剂，主要用于防杀蟑螂、蚂蚁等有害生物。虽然氟虫腈防治害虫效果很好，但是其对环境极其不友好，会对农作物周围的蝴蝶、蜻蜓等造成影响，对鱼、虾、蜜蜂、家蚕高毒。并且现有动物实验研究表明，短期摄取大量氟虫腈会对神经系统造成不良影响，长期摄取氟虫腈可能会损害肝脏、甲状腺和肾脏。因此我国规定2009年10月1日起禁用氟虫腈，目前仅可用于家庭卫生害虫。欧盟法律也规定，氟虫腈不得用于人类食品产业链的畜禽养殖过程。然而，2017年7月20日，比利时通过RASFF系统通报鸡蛋中检出氟虫腈。问题鸡蛋已被销往12个国家或地区。据报道，问题鸡蛋产自荷兰，氟虫腈被不恰当的用于养鸡场的清洁物品中，造成鸡蛋被检出残留物。此次事件说明，农药污染贯穿产品养殖、生产、加工、销售流通等各个环节，对于政府后续监管提出了更严峻的考验。“十三五”规划中也提到从农田到餐桌全链条监管，实现食用农产品全过程追溯管理。而影响政府监管或管理效果最重要的因素是对氟虫腈的检测手段，目前氟虫腈的检测还主要是针对蔬菜、环境中的杀虫剂氟虫腈检测，方法主要有高效液相法和液相色谱质联用法，这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫检测法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、分析样本量大，但现有的免疫检测的样本未能覆盖到养殖加工环节，而且灵敏度不能达到对于氟虫腈监测的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测氟虫腈的试剂盒及其制备方法与应用，具有灵敏度高、准确性强、灵敏度高、操作简便的优点，特别适用于牛、羊、猪、鸡等动物的可食组织、内脏、鸡蛋、牛奶、动物产品中氟虫腈残留快速检测。本专利技术的一个目的是提供一种氟虫腈半抗原化合物，其结构式如式Ⅰ所示：（式Ⅰ）。氟虫腈半抗原是氟虫腈和巯基丙酸反应得到的，该半抗原含有活性羧基，可以与载体蛋白偶联形成包被原和免疫原。上述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物也属于本专利技术的保护范围。其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲状腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。所述氟虫腈半抗原与载体蛋白的偶联物是指氟虫腈半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物。上述式Ⅰ所示化合物和/或上述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物在制备氟虫腈单克隆抗体中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述式Ⅰ所示化合物、上述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物和/或上述氟虫腈单克隆抗体在制备检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述式Ⅰ所示化合物的方法和一种制备上述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物的方法。本专利技术所提供的制备上述式Ⅰ所示化合物的方法，包括如下步骤：将氟虫腈、3-巯基丙酸以1000：365的重量比溶于甲醇中，纯化，旋干，终止反应，得到所述化合物。本专利技术所提供的制备上述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物的方法，包括如下步骤：1）将所述氟虫腈半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述氟虫腈半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为15.93mg：1.5mL：21.5mg：13mg。2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5mL；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5mL；3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述氟虫腈抗原。所述氟虫腈半抗原（式I）或所述氟虫腈抗原在定性或定量检测氟虫腈中的应用也属于本专利技术的保护范围。称取1±0.05g均质后的样品于50mL离心管中；依次加入1g纯化试剂、3mL乙腈（分析纯），充分涡动5min；4000g以上，离心5min；取1mL上清液于干净离心管中；50-60℃水浴氮气吹干；加入1mL样品稀释液，充分涡动1min；即得检测溶液。本专利技术的还提供了一种检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测氟虫腈的酶联免疫试剂盒，为下述1）、2）、3）或4）中任一所述酶联免疫试剂盒：1）酶联免疫试剂盒中包括上述任一所述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物、上述氟虫腈单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；2）酶联免疫试剂盒中包括上述式Ⅰ所示化合物的酶标记物、上述氟虫腈单克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；3）酶联免疫试剂盒中包括上述式Ⅰ所示化合物的酶标记物、上述氟虫腈单克隆抗体；其中，所述氟虫腈单克隆抗体作为包被原；4）酶联免疫试剂盒中包括上述任一所述式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物、上述氟虫腈单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。上述4种试剂盒的检测原理如下：当在酶标板微孔条上预包被氟虫腈半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入氟虫腈单克隆抗体溶液，样本中残留的氟虫腈或氟虫腈标准品与酶标板上包被的氟虫腈半抗原与载体蛋白的偶联物竞争氟虫腈单克隆抗体，加入酶标记二抗进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与样本中氟虫腈的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟虫腈的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度氟虫腈标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氟虫腈含量的浓度范围。当在酶标板微孔条上预包被二抗时，加入氟虫腈单克隆抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记氟虫腈半抗原溶液，样本中的氟虫腈或氟虫腈标准品与酶标记氟虫腈半抗原竞争氟虫腈特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与样本中氟虫腈的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氟虫腈的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，与系列浓度氟虫腈标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氟虫腈含量的浓度范围。当在酶标板微孔条上预包被氟虫腈单克隆抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氟虫腈本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氟虫腈的检测试剂盒，包括：氟虫腈酶标板、氟虫腈标准品工作液、氟虫腈抗体工作液、酶标记物工作液、底物液、终止液，其特征在于：所述氟虫腈酶标板由氟虫腈抗原包被制成，所述氟虫腈抗原是由氟虫腈半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原，氟虫腈半抗原为式I所示化合物：

【技术特征摘要】
1.一种氟虫腈的检测试剂盒，包括：氟虫腈酶标板、氟虫腈标准品工作液、氟虫腈抗体工作液、酶标记物工作液、底物液、终止液，其特征在于：所述氟虫腈酶标板由氟虫腈抗原包被制成，所述氟虫腈抗原是由氟虫腈半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原，氟虫腈半抗原为式I所示化合物：式I。2.根据权利要求1所述的一种氟虫腈的检测试剂盒，其特征在于，所述化合物为氟虫腈和巯基丙酸反应得到的，该半抗原含有活性羧基，可以与载体蛋白偶联形成包被原和免疫原。3.根据权利要求1所述的一种氟虫腈的检测试剂盒，其特征在于，所述化合物的制备方法包括如下步骤：将50ml圆底烧瓶冲洗干净，用乙醇吹干，将其固定在搅拌器上；称取原料1g，用10ml甲醇溶解，呈黄色，搅拌，加入365mg3-巯基丙酸，搅拌，点板检测反应，纯化，柱层析纯化，收集产物点所在溶液，旋干，即得氟虫腈半抗原。4.根据权利要求1所述的一种氟虫腈的检测试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.根据权利要求1所述的一种氟虫腈的检测试剂盒，其特征在于，所述氟虫腈抗原的制备方法包括如下步骤：（1）将所述氟虫腈半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述氟虫腈半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺的配比为15.93mg：1.5mL：21.5mg：13mg；（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，聂靖东，刘薇，邢维维，吴雨洋，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11