一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：（1）无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；（2）对样品菌液进行水浴热处理，离心，弃上清，收集菌体；（3）向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；（4）将待测样品液进行培养、观察、检测。本发明专利技术提供的检测方法特异性强，灵敏度高，而且能有效缩短检测时间，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。
技术介绍
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)是一种广泛分布于自然界的人畜共患致病性微生物，存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、蛤和虾中，也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。目前已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。小肠结肠炎耶尔森氏菌能够通过食物传播，能够引起多种动物以及人的小肠结肠炎耶尔森氏菌病，感染后主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等，严重危害人类健康。正因如此，很多国家规定，对于进出口的食品该菌是必检的常规项目。目前小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法，还主要依赖于传统的微生物学检测方法。常规的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法操作步骤复杂，并且费时，一般要3～7天，不能达到快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的要求。因此，迫切需要建立一种快速、有效的检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，以实现对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行快速检测，及早发现传染源，切断其传播途径。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题和不足，本专利技术的目的旨在提供一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：(1)无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；(2)对样品菌液进行水浴热处理，然后离心，弃上清，收集菌体；(3)向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；(4)将待测样品液进行培养、观察、检测。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(1)中所述待测样品与PBS缓冲液的质量比为1:9，所述PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度为0.5％～10％。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(2)中所述水浴热处理的温度为30℃～80℃，水浴时间为5min～30min。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(2)中所述离心温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为1min～5min。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(3)中所述振荡时间为1min～3min。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(1)中所述PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L；步骤(3)中所述洗脱液为0.02mol/L的PBS缓冲液，洗脱次数为2-3次。更加优选地，步骤(3)中所述洗脱的具体操作为：向吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入1mL0.02mol/LPBS洗脱液，振荡混合均匀后静置磁力架上，待磁珠充分被磁力聚集，弃上清。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤(3)中所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠是通过链霉亲和素修饰磁珠后偶联生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体制得。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠的具体制备方法，包括以下步骤：a)用0.01mol/L磷酸盐-吐温20缓冲液稀释小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体至1mg/ml；用无水二甲亚砜(DMSO)配制10mg/ml生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液(BNHS溶液)，将稀释的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体与生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯溶液按体积比为1:3.3进行混合，室温下孵育，即得生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体；b)向生物素标记的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体中加入1mg已活化溶解的链霉亲和素修饰磁珠进行混合，得到抗体与磁珠的混合物，室温放置；c)向步骤b)制得的混合物中加入7.8μL1mol/LNH4Cl溶液，室温孵育；上1ml的分子筛柱，以PBS缓冲液洗脱，收集1ml/管，加入PBS缓冲液与0.01％叠氮钠的混合液，置-20℃避光保存。根据上述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，优选地，步骤a)中所述磷酸盐-吐温20缓冲液的pH值为6.5。与现有技术相比，本专利技术取得的积极有益效果如下：(1)本专利技术在对样品检测前，采用含Al(OH)3的PBS缓冲液进行前处理，能够破坏待测样品中大量的杂菌，减少杂菌的干扰，提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率，使菌体更加稳定；水浴热处理能够进一步杀灭样品中的非目标菌，减少杂菌的干扰，同时，还能使样品中的蛋白发生变性，降低样品中蛋白大分子的干扰；水浴后离心处理有利于样品中菌体和杂质快速分离和减少杂质；利用小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠与菌体中目标菌的特异性结合，达到富集样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的目的，增加小肠结肠炎耶尔森氏菌检出率，有效避免或减少假阳性现象的发生，提高了小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测准确性，同时也缩短了检测时间。(2)本专利技术将PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度控制为0.5％～10％，在该质量浓度范围内Al(OH)3能够破坏待测样品中大量的杂菌，减少杂菌的干扰，使小肠结肠炎耶尔森氏菌更加稳定的生长，提高小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率和检测结果准确性。而Al(OH)3的浓度过低，则起不到破坏杂菌的目的，不能减少杂菌对目标菌检测的干扰；如果Al(OH)3的浓度过高，样品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌易被破坏，不利于后续小肠结肠炎耶尔森氏菌的富集和检测，而且会导致检测结果不准确。(3)水浴热处理选择在30℃～80℃水浴对样品菌液热处理5min～30min，该水浴处理条件能够杀灭样品中的非目标菌，减少杂菌干扰，同时还能使样品中的蛋白发生变性，降低样品中蛋白大分子的干扰，进一步增大目标菌的检出率，提高检测结果的准确性；而且，该水浴热处理条件对小肠结肠炎耶尔森氏菌的活性影响小。(4)制备免疫磁珠时，高浓度的BNHS溶液会导致多个生物素分子结合在抗体上，致使所有抗体都被标记，较低的浓度的BNHS溶液则会是使生物素化保持在最低限度，致使抗体生物素化不足，因此，为了给目标菌抗体提供适宜的生物素化程度，防止目标菌抗体生物素化不足或者过多，干扰后续检测结果的准确性，本专利技术选择用无水DMSO配制10mg/mlBNHS溶液。(5)在PBS缓冲液中加入Tween-20，利用该缓冲液对抗体溶液进行稀释，能够除去未结合的生物素，防止反应混合液中有游离氨基存在，而抑制小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体的生物素标记反应，提高检测结果的准确性。(6)本专利技术制备的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠具有免疫反应的高度特异性和磁分离的快速、简单的优点，能够特异性捕获、吸附菌体中的小肠结肠炎耶尔森氏菌，将小肠结肠炎耶尔森氏菌从样品中快速分离，达到富集样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的目的，而且富集速度快，灵敏度高，很好地解决低含量低水平的病原微生物的检测问题；还能够降低样品中杂质干扰，有效避免或减少假阳性现象的发生，提高了小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率，同时也缩短了检测时间。(7)本专利技术检测方法检测灵敏度高(可达到10-8)，特异性强，准确性高，而且检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；（2）对样品菌液进行水浴热处理，然后离心，弃上清，收集菌体；（3）向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；（4）将待测样品液进行培养、观察、检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）无菌条件下取待测样品，加入含Al(OH)3的PBS缓冲液中，均质，获得样品菌液；（2）对样品菌液进行水浴热处理，然后离心，弃上清，收集菌体；（3）向菌体中加入小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠，经混合、振荡后于磁力架上静置分层，弃上层，得到吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠；用洗脱液对吸附有菌体的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠进行洗脱，然后向洗脱后的小肠结肠炎耶尔森氏菌免疫磁珠中加入PBS缓冲液，混合均匀，得到样品待测液；（4）将待测样品液进行培养、观察、检测。2.根据权利要求1所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（1）中所述待测样品与PBS缓冲液的质量比为1:9，所述PBS缓冲液中Al(OH)3的质量浓度为0.5%～10%。3.根据权利要求1所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（2）中所述水浴热处理的温度为30℃～80℃，水浴时间为5min～30min。4.根据权利要求1-3任一所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（2）中所述离心温度为4℃，转速为4000rpm，离心时间为1min～5min。5.根据权利要求4所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步骤（3）中所述振荡时间为1min～3min。6.根据权利要求5所述的检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：周莉，李永利，毛晓娜，张立攀，关炳峰，平洋，张亚勋，谭静，任钊，王潇，李栋，蒋碧伟，高瑞，吴晶晶，王春杰，
申请(专利权)人：河南省商业科学研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南,41