一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用技术

本发明专利技术公开一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用，该细胞命名为人低级别胶质瘤原代细胞XHLG‑07，人高级别胶质瘤原代细胞XHHG‑02，保藏编号分别为CCTCC NO：C2018256、CCTCC NO：C2018215，分离培养方法为：体外获取临床术后切除胶质瘤组织，解剖镊子去除组织中血管及脂肪组织，经胶原酶/胰酶消化作用，过滤，低速离心获取细胞沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞后，用DF31完全培养基重悬细胞并接种培养，分离方法可用于WHO不同分级胶质瘤原代细胞获取，所得细胞可在体外、体内分析不同级别人脑胶质瘤的发病机制，药物敏感性及转移性，为不同级别人脑胶质瘤研究提供更接近于临床肿瘤生物学特性的研究材料。

【技术实现步骤摘要】
一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用
本专利技术属于细胞生物学领域，更具体的，涉及一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用。
技术介绍
胶质瘤是神经系统最常见的颅内恶性肿瘤，为起源于神经胶质细胞的肿瘤。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，胶质瘤分为WHOI-IV级，其中I、II为低级别胶质瘤，III和IV级为高级别胶质瘤。近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，以老年群体尤为显著。胶质瘤发病率约占所有中枢神经系统肿瘤的30％，其中胶质母细胞瘤的发病率最高，约为3.2/10万，其次是弥漫性星形细胞瘤，发病率为0.53/10万。尽管应用各种治疗方法，包括手术切除，放疗和化疗，胶质瘤患者的预后仍差。针对胶质瘤这种发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的特点，近年来针对胶质瘤发病机制的研究处于热门领域，主要研究方向包括信号通路研究及基因水平变异的研究。然而，胶质瘤的发病机制依然尚未明确。现阶段针对胶质瘤研究的主要模型仍然是肿瘤细胞系(patient-derivedcancercelllines,PDC)。然而，目前全球范围内用于基础研究及药敏检测的脑瘤细胞系屈指可数且肿瘤细胞系具有严重的缺陷,即体外培养的过程中易丢失肿瘤细胞的异质性和肿瘤细胞在体内的特征，目前，在脑肿瘤临床治疗常用手段主要有手术治疗、放射治疗和化疗，另外还有一些比较新的治疗方法，如免疫治疗、以EGFR、IGFR、PDGFR等为靶点的靶向治疗和抗血管生成的治疗方法。这些方法通常根据病人的实际情况进行联合应用，但对于脑肿瘤的治疗效果却不尽人意。因此临床上不仅需要新型的治疗方法，同时也需要开发有效的治疗药物。申请号为CN201210299549.6的专利公开一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用，其是以高级胶质瘤细胞原代细胞作为研究模型，采用DMEM/F12完全培养液培养纯化GLC-001细胞，然后使用含有胎牛血清的RPMI1640培养液培养。该申请涉及为高级别胶质瘤细胞系，以往研究认为，体外多次传代细胞系形态趋于均一，逐渐丧失了原代胶质瘤细胞的异质性，由于其遗传背景发生变化，无法准确反映临床患者的真实生理反应。而且该申请仅涉及胶质瘤的高级别类型细胞系，对于低级别胶质瘤的相关研究无法提供有效的研究系统。根据以往研究表明低级别胶质瘤原代细胞体外极难获得及进行传代培养，而本申请是以高级胶质瘤细胞和低级胶质瘤细胞作为研究模型，采用DF31完全培养基培养两种细胞，为不同等级的细胞研究提供了模型，及不同药物针对不同等级细胞的筛选和发病机理提供了研究模型。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现今科研领域研究模型的不足，提供一种人胶质瘤原代细胞及其体外分离培养方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种人胶质瘤原代细胞，包括人高级别胶质瘤原代细胞XHHG-02和人低级别胶质瘤原代细胞XHLG-07，其保藏编号分别为CCTCCNO：C2018215，CCTCCNO：C2018256。上述人胶质瘤原代细胞的体外分离培养方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜临床人脑胶质瘤手术切除的胶质瘤组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，用解剖剪刀将胶质瘤组织剪至糜状获得样本组织；(2)将步骤(1)样本组织用消化液消化；所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；(3)消化后组织用无菌过滤器收集细胞悬液，收集后，低速离心去上清，收集细胞沉淀；(4)将步骤(3)收集细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温放置，轻柔上下颠倒促进红细胞裂解，低速离心，收集细胞沉淀；(5)将步骤(4)收集的细胞沉淀用1XPBS漂洗，低速离心收集细胞沉淀；(6)重悬步骤(5)收集的细胞沉淀于DF31完全培养基，接种于细胞培养瓶培养，获得人胶质瘤原代细胞。所述的人胶质瘤原代细胞培养条件优选为用DF31完全培养基于37℃，5％CO2培养；所述的DF31完全培养基为：DMEM/F12培养基添加1xN2、1mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5ug/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100ug/ml肝素、5ng/ml孕酮及100U/mL青霉素、100ug/ml链霉素、0.25ug/mL两性霉素B。上述DF31完全培养基需经过0.22um孔径滤膜过滤后使用。步骤(2)中消化液用量为5倍于组织样本体积，消化条件为37℃，60rpm震荡消化1-1.5h；胶原酶和胰酶浓度分别为1x浓度和0.25％胰酶-0.2％EDTA。步骤(3)、(4)、(5)中离心条件为1000rpm，4分钟；步骤(6)中的培养条件为37℃、5％CO2。上述人胶质瘤原代细胞的传代培养方法，优选操作步骤如下：A、除去旧培养基，用PBS漂洗2次后，用0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞，消化时间为2-3min；B、加入DF31完全培养基终止消化反应，1000rpm，4分钟，离心去上清，用DF31完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养获得子代细胞，培养条件为37℃、5％CO2。本专利技术提供上述人胶质瘤原代细胞及子代细胞的用途。其中所述较佳用途包括一种筛选治疗胶质瘤最佳敏感药物的方法，其中较佳操作步骤如下：将测试药物添加至细胞模型中，根据药物作用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的程度，筛选最佳敏感性测试药物为治疗人胶质瘤的候选药物，其中所述细胞模型为本专利技术所述的人胶质瘤原代细胞。其中所述筛选方法为常规筛选方法，所述筛选方法较佳的包括以下步骤：(1)将2000个/孔的人胶质瘤原代细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；(2)将测试药物稀释成不同浓度作用于细胞，药物作用72小时后测定细胞活力，计算不同浓度药物对细胞增殖抑制能力，用以评估测试药物的抗肿瘤能力。其中步骤(2)所述用以评估测试药物的抗肿瘤能力的方法为本领域常规检测及计算方法。其中所述检测方法较佳的包括MTT法或CCK-8法，本专利技术所述检测方法优选的为CCK-8法。优选的CCK-8法全称CellCountingKit-8，其原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazandye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。优选的CCK-8法为MTT法的替代法，其特征为快速、低毒、灵敏度高及重复性佳。本专利技术的人高级别胶质瘤原代细胞及人低级别胶质瘤原代细胞的STR基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示：人高级别胶质瘤原代细胞的STR序列为：AMEL-X，CSF1P0-12/13，D10S1248-14/15，D12S391-20，D13S317-10，D16S539-9/10，D18S51-14/20，D19S433-13/15.2，D2S441-10，D21S11-29/32，D2S1338-18/24，D3S1358-15，D5S818-10/12，D6S1043-10/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胶质瘤原代细胞，其特征在于，包括人高级别胶质瘤原代细胞XHHG‑02和人低级别胶质瘤原代细胞XHLG‑07，其保藏编号分别为CCTCC NO：C2018215，CCTCC NO：C2018256。

【技术特征摘要】
1.一种人胶质瘤原代细胞，其特征在于，包括人高级别胶质瘤原代细胞XHHG-02和人低级别胶质瘤原代细胞XHLG-07，其保藏编号分别为CCTCCNO：C2018215，CCTCCNO：C2018256。2.权利要求1所述的一种人胶质瘤原代细胞的体外分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)收集新鲜临床人脑胶质瘤手术切除的胶质瘤组织，用解剖镊子于显微镜下去除血管、脂肪及坏死成分，用解剖剪刀将胶质瘤组织剪至糜状获得组织样本；(2)将步骤(1)组织样本用消化液消化；所述消化液为含胶原酶及胰酶的DMEM培养基；(3)消化后组织无菌过滤器收集细胞悬液，收集后，低速离心去上清，收集细胞沉淀；(4)在步骤(3)收集的细胞沉淀加入红细胞裂解液，室温放置，轻柔上下颠倒促进红细胞裂解，低速离心，收集细胞沉淀；(5)将步骤(4)收集的细胞沉淀用1XPBS漂洗，低速离心收集细胞沉淀；(6)重悬步骤(5)收集的细胞沉淀于DF31完全培养基，接种于细胞培养瓶培养，获得人胶质瘤原代细胞。3.如权利要求2所述的一种人胶质瘤原代细胞的体外分离培养方法，其特征在于，所述DF31完全培养基为：DMEM/F12培养基添加1xN2、1mM丙酮酸钠、1x非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5ug/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100ug/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红亚，熊南翔，李俊俊，王前进，王轩，徐豪，王艺淏，屈彦魁，
申请(专利权)人：武汉赛尔朗灵科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42