抗-CIZ1抗体制造技术

CIZ1在小细胞肺癌和其他多种癌症中呈现癌症特异性高表达。制备的抗体，能够与细胞表面的CIZ1全长蛋白质和变异体和/或其片断的抗原决定簇特异性结合，在体外和体内抑制肿瘤生长，应用于癌症的治疗与检测。

【技术实现步骤摘要】
抗-CIZ1抗体
本专利技术公布一种抗-CIZ1抗体的制备和使用方法
技术介绍
Cdkn1A-interactingzincfingerprotein1(Ainscough，Rahmanetal.)是一种能够与p21Cip1/Wafl结合的锌指蛋白，是Mitsui等于1999年发现的(Mitsui，Matsumotoetal.1999)。CIZ1不仅能够与CDK2(Cyclin-dependentkinase2)抑制剂p21Cip1/Wafl结合，而且还能够与CDK2、cyclinA、cyclinE、CDC6(Celldivisioncycle6)、雌激素受体α(estrogenreceptor-α)，以及其他多种蛋白质结合。CIZ1在DNA复制与细胞生长的过程中起作用，并且与癌症、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)、肌肉张力障碍症(dystonia)、以及类风湿关节炎(rheumatoidarthritis)等疾病相关(Liu，Niuetal.2016；Pauzaite，Thackeretal.2016)。CIZ1全长蛋白质(NP_036259.2)有898个氨基酸(序列号码1)，可以分为位于N端的DNA复制域和位于C端的核基质锚定域两个部分。人的CIZ1基因位于9q34，其DNA大约38kb。人全长CIZ1mRNA有18个外显子(NM_001257975.1)，经过不同的剪切，形成2.7-3.2kb的mRNA转录产物。CIZ1参与DNA复制前复合物和复制体的形成。在细胞周期的G1期CIZ1与cyclinE结合，促进Cdc6的召集。同时，C1Z1通过其核基质结合功能稳定复制前复合物和复制体。CIZ1在细胞周期的G0/G1期保持低水平，但是在早S期显著增加，并在晚S期达到峰值。抑制CIZ1不仅能够显著降低细胞生长率，而且还能够减少细胞进入S期的比例(Coverley，Marretal.2005)。CIZ1在多种恶性肿瘤中呈现高表达，包括肺癌(Higgins，Roperetal.2012)，Ewing肿瘤(Rahman，Ainscoughetal.2007；Rahman，Azizetal.2010)，结肠癌(Yin，Wangetal.2013；Wang，Wangetal.2014)，胆囊癌(Zhang，Wangetal.2015)，前列腺癌(Liu，Renetal.2015)，乳腺癌(denHollanderandKumar2006；denHollander，Rayalaetal.2006)，胃癌(Kim，Hahnetal.2004)，肝细胞癌(Lei，Wuetal.2016；Wu，Leietal.2016)，肝脏未分化胚胎肉瘤(Hu，Chenetal.2012)。CIZ1与雌激素受体结合增加其下游靶基因的表达，促进乳腺癌的发生(denHollander，Rayalaetal.2006)。CIZ1能够与beta-cateninTcellfactor4(TCF4)结合，调控Int/Wingless(Wnt)信号传导系统(Zhang，Wangetal.2015)。CIZ1的过量表达增加Wnt靶基因c-Myc，Snail和CyclinD1的表达，促进胆囊癌细胞的生长和迁移。CIZ1能够作用于p53下游靶点DNAdamage-regulatedgene1(PDRG1)，后者在结直肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、子宫癌中高表达。CIZ1能够诱导肿瘤相关基因AKT和PSA/KLK3的表达(Liu，Renetal.2015)。CIZ1过量表达促进多种癌症细胞的生长、转移、侵袭、集落形成、以及在动物模型中促进肿瘤生长(Yin，Wangetal.2013；Liu，Renetal.2015；Zhang，Wangetal.2015)。而抑制CIZ1的表达能够在动物模型中降低肿瘤的形成(Zhang，Wangetal.2015)。CIZ1mRNA剪切变异体与癌症相关，例如，缺失第四个外显子的CIZ1剪接变异体CIZ1ΔE4(序列号码2)独特地出现在Ewing肿瘤细胞中(Rahman，Ainscoughetal.2007)；缺失第14外显子3’端最后24个核苷酸的变异体CIZ1Δ14b(序列号码3)特异性地出现在肺癌中(Higgins，Roperetal.2012)。基于CIZ1在癌症发生发展中的作用，CIZ1及其变异体可以作为癌症诊断标准物或者治疗靶点。
技术实现思路
一般认为，CIZ1位于细胞核内的核基质中(Mitsui，Matsumotoetal.1999；Ainscough，Rahmanetal.2007)。但是，当CIZ1和p21Cip1/Wafl共转染到细胞中，两者都从细胞核转位到细胞质(Mitsui，Matsumotoetal.1999)。这些结果都不能排除部分CIZ1及其变异体在某个阶段分布于细胞表面。而且在CIZ1及其变异体降解的过程中，其片断可以通过MajorHistocompatibilityComplex(MHC)系统(Konig2002；vanKasteren，Overkleeffetal.2014)或者其他途径递呈到细胞表面。位于细胞表面的CIZ1及其变异体蛋白质及其片断可以作为治疗或者诊断抗体发展的靶点。本项专利技术，是用位于细胞表面的CIZ1全长与变异体蛋白质及其片断作为免疫原制备具有治疗和诊断功能的抗体。根据本项专利技术，细胞表面高水平表达CIZ1及其变异体蛋白质及其片断的肿瘤细胞，例如小细胞肺癌NCI-H69和NCI-H526免疫BALB/c小鼠，免疫小鼠的脾脏中的B细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞融合，分泌抗体的杂交瘤细胞用CIZ1及其变异体蛋白质及其片断进行筛选。挑选与CIZ1及其变异体蛋白质及其片断反应滴度高的杂交瘤扩大培养，制备杂交瘤抗体。根据本项专利技术，制备的抗体以不同浓度加入到培养中的不同肿瘤细胞中，用MTS方法检测细胞活性，从而检测所制备的抗体对不同的肿瘤细胞生长的特异性抑制作用。根据本项专利技术，制备的抗体与肿瘤细胞孵育反应，结合在肿瘤细胞表面的抗体再与荧光标记的二抗结合，经过荧光激活细胞分离仪对细胞进行分析，从而确定制备抗体特异性结合于肿瘤细胞表面。根据本项专利技术，用肿瘤细胞皮下注射的方法在裸鼠上建立肿瘤，待肿瘤生长到一定体积时，制备的抗体以一定的剂量注射到载瘤小鼠。记录载瘤小鼠的肿瘤体积变化，确定制备抗体对实验动物肿瘤的治疗功能。同时记录载瘤小鼠的体重变化，确定制备抗体对实验动物没有严重的副作用。根据本项专利技术，用RT-PCR和特定的引物，获得制备抗体的基因序列并推导出抗体的蛋白质序列。将制备抗体的基因序列和蛋白质序列与数据库中所有抗体序列进行分析，确定制备抗体序列的特异性，确定制备抗体是新分子实体(NME)，确定制备抗体的CDR区(ComplementarityDeterminingRegions)和FR区(FrameworkRegions)。根据本项专利技术，制备的抗体可以是全长抗体、多特异抗体(multispecificantibody)、双特异抗体(bispecificantibody)、单价抗体(monovalentantibody)、多价抗体(multivalen本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的抗体，能够与细胞表面的CIZ1全长蛋白质(序列号码1)和变异体(序列号码2；序列号码3)和/或其片断特异性结合。

【技术特征摘要】
1.分离的抗体，能够与细胞表面的CIZ1全长蛋白质(序列号码1)和变异体(序列号码2；序列号码3)和/或其片断特异性结合。2.根据权利要求1，所述抗体包括，全长抗体、多特异抗体(multispecificantibody)、双特异抗体(bispecificantibody)、单价抗体(monovalentantibody)、多价抗体(multivalentantibody)、抗独特型抗体(anti-idiotypicantibody)、微型双功能抗体(diabody)、Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段、ScFv片段，和其他免疫反应片断，以及融合蛋白质。3.根据权利要求1，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡胜和，刘瑾，
申请(专利权)人：蔡胜和，
类型：发明
国别省市：天津,12