蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于一种蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用；采用划痕实验、小管形成实验和鸡胚绒毛尿素膜血管生成实验观察蒲公英多糖对血管新生的影响，利用免疫组化研究蒲公英多糖对H22肝癌细胞荷瘤小鼠皮下瘤血管生成的影响；利用qPCR、Western blot和ELISA分别在细胞和动物水平检测血管生成相关因子mRNA和蛋白表达；能够有效证明蒲公英多糖通过抑制肿瘤血管生成发挥抗肿瘤作用，其能够通过下调肿瘤细胞VEGF、VEGFR‑2表达，在体内外抑制肿瘤血管生成；具有能够有效抑制肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤作用的优点。

Application of dandelion polysaccharide in preparation of anti-angiogenesis drugs for hepatocellular carcinoma cells

【技术实现步骤摘要】
蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。
技术介绍
血管生成(angiogenesis)，angiogenesis一词始见于1900年一篇讨论肾上腺生长的论文，作者鲁道夫·斯特纳，发表在《约翰霍普金斯医院报告》上。“angio”是指血管，“genesis”指起源；血管生成是肿瘤新生血管形成的关键因素，血管生成包括以下几个步骤：小血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，细胞在基质中迁移、增殖，内皮细胞组件为中空管道，管道最终吻合形成新的毛细血管。近期通过肿瘤实验动物模型证明了类似的过程；血管的发生对人类肿瘤的作用还不清楚，但部分学者认为此机制可以作为肿瘤治疗的靶目标，但学术界还没有统一思想；一般来说，抗血管生成治疗的抗肿瘤作用理论已经经历了至少3个阶段。首先，抗血管生成治疗被认为可以减少肿瘤血管的形成，从而减少对肿瘤的灌注和营养供应，导致肿瘤休眠，甚至可能导致肿瘤萎缩。其次，研究人员发现肿瘤血管形成的减少与肿瘤组织中缺氧和酸中毒的减少有关，表明肿瘤灌注在抗血管生成治疗后得到改善，这与预期机制是相反的，但却有助于改善药物输送程度，从而得到更好的治疗效果。近年来，肿瘤血管生成素调节肿瘤免疫微环境的作用日益受到重视，血管内皮生长因子和肿瘤微环境中的其他促血管生成因子可下调细胞间粘附分子1(ICAM-1)或血管细胞粘附蛋白1(VCAM-1)，从而抑制T细胞转运，抑制树突状细胞成熟。微环境缺氧也可招募免疫抑制细胞，包括调节性T细胞(Treg)、髓系来源抑制细胞(MDSCs)和M2型巨噬细胞。而抗血管生成药物可以逆转这些现象，并与免疫抑制治疗一起产生协同抗肿瘤作用。具体到肝癌细胞来说，肝癌血供丰富，血管生成能力较强是其发生迁移侵袭并导致肿瘤复发转移的重要因素，血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常，且血管基质不完善，这种微血管容易发生渗漏，因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。越来越多的研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。因此开发新的针对肝细胞癌的系统疗法，尤其是针对肝癌细胞血管生成则具有重大意义。另外，蒲公英多糖公知的具有包括抗菌、抗氧化、免疫调节、抗突变、抗疲劳和激素调节的相关药理作用，并不具有抑制肝癌细胞血管生成的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷提供一种能够有效抑制肝癌细胞血管生成的蒲公英多糖，并且还提供了蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。本专利技术的目的是这样实现的：蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。本专利技术还提供了所述肝癌包括人肝癌HepG2细胞、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC、小鼠肝癌细胞H22。优选地，所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的迁移。优选地，所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC血小管的形成。优选地，所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制小鼠肝癌细胞H22皮下瘤组织血管的生成。优选地，所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人肝癌HepG2细胞VEGF、VEGFR基因的表达。优选地，所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制H22肝癌荷瘤小鼠血清VEGF和VEGFR-2的含量。本专利技术还提供了所述抑制肝癌细胞血管生成药物中应用蒲公英多糖的有效浓度为100～400mg/L。本专利技术还提供了所述抑制肝癌细胞血管生成药物中应用蒲公英多糖的有效浓度为200mg/L。本专利技术采用划痕实验、小管形成实验和鸡胚绒毛尿素膜血管生成实验观察蒲公英多糖对血管新生的影响，利用免疫组化研究蒲公英多糖对H22肝癌细胞荷瘤小鼠皮下瘤血管生成的影响；利用qPCR、Westernblot和ELISA分别在细胞和动物水平检测血管生成相关因子mRNA和蛋白表达；能够有效证明蒲公英多糖通过抑制肿瘤血管生成发挥抗肿瘤作用，其能够通过下调肿瘤细胞VEGF、VEGFR-2表达，在体内外抑制肿瘤血管生成。蒲公英多糖为天然植物提取物，能够有效抑制肿瘤血管生成从而达到抗肿瘤作用的目的，具有广阔的应用前景。附图说明图1为实施例1中通过细胞划痕实验观察蒲公英多糖的有效浓度对HUVEC细胞迁移能力影响图。图2为图1中HUVEC细胞迁移指数统计图。图3为实施例1中通过小管形成实验观察蒲公英多糖对HUVEC细胞小管形成能力影响图。图4为图3中HUVEC细胞小管形成能力影响统计图。图5为实施例1中通过鸡胚尿胚囊膜血管生成实验观察蒲公英多糖对血管生成的影响图。图6为实施例1中通过CD31抗体标记的H22肝癌细胞荷瘤小鼠皮下瘤微血管形态图。图7为图6中CD31抗体标记的H22肝癌细胞荷瘤小鼠皮下瘤微血管密度(MVD)统计图。图8为实施例1中通过qPCR检测蒲公英多糖对HepG2细胞VEGFmRNAs的表达统计图。图9为实施例1中通过qPCR检测HepG2细胞VEGFR-2mRNAs的表达统计图。图10为实施例1中通过WesternBlot检测HepG2细胞中VEGF和VEGFR-2的表达图。图11为实施例1中通过ELISA实验检测H22肝癌细胞荷瘤小鼠血清VEGF、VEGFR含量统计图。蒲公英多糖的英文名称为：Dandelionpolysaccharide，在上述图1～图11中简称DP。具体实施方式下面通过实验并结合实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，附图以及以下内容并不限制本专利技术的保护范围。实施例1本专利技术为蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。本专利技术还提供了所述肝癌包括人肝癌HepG2细胞、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC、小鼠肝癌细胞H22。所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的迁移。所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC血小管的形成。所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制小鼠肝癌细胞H22皮下瘤组织血管的生成。所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人肝癌HepG2细胞VEGF、VEGFR基因的表达。所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制H22肝癌荷瘤小鼠血清VEGF和VEGFR-2的含量。本专利技术还提供了所述抑制肝癌细胞血管生成药物中应用蒲公英多糖的有效浓度为100～400mg/L。本专利技术还提供了所述抑制肝癌细胞血管生成药物中应用蒲公英多糖的有效浓度为200mg/L。1、药物：蒲公英多糖从杨凌慈缘生物技术有限公司购置。2、动物与细胞：人脐静脉内皮细胞系HUVEC购自中科院典型培养物保藏委员会细胞库；人肝癌细胞HepG2，小鼠肝癌细胞系H22购自中科院上海细胞库；BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；受精鸡蛋购自江苏省沭阳县韩山生态农场。3、抗体：血管内皮生长因子(v本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.蒲公英多糖在制备抑制肝癌细胞血管生成药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝癌包括人肝癌HepG2细胞、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC、小鼠肝癌细胞H22。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的迁移。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVEC血小管的形成。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肝癌细胞血管生成药物能抑制小鼠肝癌细胞H22皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，任峰，杨赟，罗艳艳，吴凯旋，冯思佳，王阳林，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41