基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法技术

一种基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，用带有凹孔的平板代替普通酶标板包被抗原/抗体；配置满足打印要求的酶标抗体溶液、显色液和终止液，并添加至墨盒；利用平板喷墨打印机打印添加配置的试剂的方式进行酶联免疫操作；利用照相工具将凹孔内的显色结果转换成可传输的图片形式，其中图片内包括颜色的深浅信息；利用软件对图像进行数据分析，根据分析结果计算得出被测物的含量。本发明专利技术将传统的96孔酶标板改为带有凹孔的平板，有利于拍照采集图像，试剂使用量大大减少；并根据喷墨打印技术，设计出满足要求的试剂配方，使打印操作能够实现，然后利用软件分析结果，对条件落后和不发达地区的医疗诊断状况有重要意义。

Quantitative Detection of Visual Enzyme-linked Immunoassay Based on Flat Printing

A quantitative detection method of visual enzyme-linked immunoassay based on plate printing was proposed, in which antigen/antibody was coated with a plate with holes instead of a common enzyme-labeled plate; enzyme-labeled antibody solution, chromogenic solution and termination solution were configured to meet the printing requirements and added to the ink cartridge; enzyme-linked immunoassay operation was carried out by printing the reagent added by a flat ink-jet printer; and the holes were covered by a photographic tool. The results of color rendering are converted into transferable pictures, in which the picture contains the information of color depth; the image is analyzed by software, and the content of the measured object is calculated according to the analysis results. The invention changes the traditional 96-hole enzyme plate into a flat plate with concave holes, which is advantageous for photographing and collecting images, and greatly reduces the use of reagents; and according to inkjet printing technology, designs reagent formulation to meet the requirements, so that printing operation can be realized, and then uses the results of software analysis, which is of great significance for medical diagnosis in backward and underdeveloped areas.

【技术实现步骤摘要】
基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法
本专利技术涉及一种可视化酶联免疫的定量检测方法，具体涉及一种基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，属于生物检测

技术介绍
酶联免疫吸附测定法（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。由于其具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。它以免疫学反应为基础，将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的体外诊断技术。传统的酶联免疫分析方法采用96孔酶标板作为反应容器，96孔酶标板有8×12个孔位，每个孔为大小、高度、形状均相等的圆柱形，有1.2cm的纵深；涉及的试剂方面包括包被液（抗原或抗体）、封闭液、酶结合物(酶标记抗原或抗体)、酶反应底物、酶反应终止液、洗涤液、样品稀释液、实验质控物(阳性对照血清、阴性对照血清)等，当前操作时每孔中试剂的添加量为50uL或100uL，对试剂的耗费量非常大，且污染环境；且当前是使用酶标仪来进行检测信号的读出，而酶标仪价格昂贵且只能安放于实验室，限制了其在条件落后及不发达地区的开展和应用。因此发展一种无需专业仪器、简单有效的免疫分析方法有着重大的需求，这对改善条件落后和不发达地区的医疗诊断状况具有十分重要的意义。而如果将当前通用的酶标板直接用于本申请中的拍照采集，位于视野中央的孔为俯视角度能直接拍到反应液的颜色，而位于视野边缘的孔为侧视角度，不能直接拍到反应液，只能拍到孔的侧壁，会导致结果分析上的巨大偏差；且如果直接用于本申请中的打印机添加试剂，由于孔太高，会喷在孔壁上，影响实验结果的准确性。如果将当前通用的试剂直接用于本申请中的打印机打印添加试剂，由于现有的酶标抗体稀释液、显色液、终止液等特殊材料液体因粘度低、表面张力高，很难通过喷墨打印机均匀地打印出来。通过对国内申请文件进行检索，发现有可视化酶联免疫方面的文件。如申请号CN201810603104.X，名称为“一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法”的专利技术专利申请公开了一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，通过先在板上固定一层纤维素用于抗原的吸附，然后加入邻苯二甲酸二丁酯标准液与固定在酶标板上的邻苯二甲酸二丁酯竞争一抗，使固定在板上的一抗进一步与辣根过氧化酶（HRP）修饰的二抗复合物结合，形成竞争型的免疫传感器；在HRP催化下，TMB被H2O2氧化成TMB2+（酸性条件）；加入TMB2+将金纳米棒刻蚀成不同的长径比,从而呈现出丰富多彩的颜色。随着目标物邻苯二甲酸二丁酯的增加，固定在板上的HRP量反而减少,使得金纳米棒被刻蚀的程度减小，从而呈现不同的颜色；该方法可以通过裸眼判断酶标板的颜色，进行邻苯二甲酸二丁酯的半定量分析，具有操作简单，灵敏度高，特异性好等特点。又如申请号CN201610761501.0，名称为“一种基于贵金属纳米粒子的可视化检测方法及应用”的专利技术专利申请公开了一种基于贵金属纳米粒子的可视化检测方法及应用，涉及免疫检测分析领域。所述方法将酶的高效催化性能与贵金属纳米粒子高的消光系数相结合，大大降低了酶的可视化检测浓度，同时酶浓度的微小变化可方便的通过所得纳米溶胶的颜色来区分，在一定的酶浓度范围内可通过肉眼直接半定量检测酶的浓度。将此方法与传统的酶联免疫方法(ELISA)相结合，可高灵敏的可视化检测各种肿瘤标志物、细菌、病毒等。该方法是基于纳米粒子直接原位生长导致溶液颜色从无色到有色的明显变化，不需要任何复杂的探针修饰过程和精密的仪器设备，使得该方法简单、低耗，因此具有很大的实用价值。上述方法都还是在原有酶标板上利用贵金属独特的光学特性来方便肉眼识别，与本文件中的可视化酶联免疫定量检测方法完全不同。
技术实现思路
本专利技术针对当前常规的酶联免疫定量分析中采用酶标仪对酶标板孔中内显示的颜色进行检测来得到被测物浓度的方法而造成的价格昂贵且使用不便等问题，提出了一种简单方便的基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法。本专利技术为解决上述问题所采用的技术手段为：一种基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，用带有凹孔的平板代替普通酶标板包被抗原/抗体；配置满足打印要求的酶标抗体溶液、显色液和终止液，并添加至墨盒；利用平板喷墨打印机打印添加配置的试剂的方式进行酶联免疫操作；利用照相工具将凹孔内的显色结果转换成可传输的图片形式，其中图片内包括颜色的深浅信息；利用软件对图像进行数据分析，根据分析结果计算得出被测物的含量。进一步地，配置满足打印要求的酶标抗体溶液是指：先用直接ELISA法对购买的酶标抗体进行效价，再配置稀释液根据效价将商业购买的酶标抗体进行稀释。进一步地，稀释液的配置方式为：取50μL吐温20、1mL甘油以及0.5g牛血清白蛋白溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液，定容至100mL。进一步地，磷酸盐缓冲液pH值为7.2。进一步地，满足打印要求的显色液配置包括显色液A的配置和显色液B的配置。进一步地，显色液A的配置方法为：取50μL吐温20、1mL甘油、60μL30%过氧化氢、0.32g柠檬酸以及2.72g醋酸钠，蒸馏水定容至100mL。进一步地，显色液B的配置方法为：取50μL吐温20、1mL甘油以及20mg四甲基联苯胺溶于10mL无水乙醇，完全溶解后蒸馏水定容至100mL。进一步地，满足打印要求的终止液配置方法为：取50μL吐温20、1mL甘油以及10g98%硫酸，蒸馏水定容至100mL。进一步地，利用照相工具将凹孔内的显色结果转换成可传输的图片形式是指利用数码相机或手机对显色的平板拍照。进一步地，利用软件对图像进行数据分析，根据分析结果计算得出被测物的含量是指将图片导入ImageJ软件中，利用软件将图片内颜色的深浅转换为灰度，根据对灰度值的计算得出被测物的含量。本专利技术的有益效果是：1．将传统的96孔酶标板改为带有凹孔的平板，有利于拍照采集图像。2．酶标抗体、显色液、终止液均采用喷墨打印技术加样，实现半自动化检测，节省人力物力，使检测过程快速简便；且每打印一次溶液使用量相比原来大量减少，成本降至原来的10%以下；同时，因为显色液、终止液为有机物和强酸，节能减排减少了环境污染。3．为了适合喷墨打印技术，设计了酶标抗体稀释液、显色液、终止液配方，对溶液的粘度和表面张力进行了匹配，已使操作能够通过打印实现。4．利用软件分析结果图像，代替常用的酶标仪，操作简单，经济实惠，只需一个手机和一台便捷式笔记本电脑即可完成检测分析，对条件落后和不发达地区的医疗诊断状况有重要意义。附图说明图1为带凹孔的平板上用喷墨打印半自动化操作酶联免疫检测不同浓度甲胎蛋白溶液的颜色变化图；图2为标准96孔酶标板手工操作酶联免疫检测不同浓度甲胎蛋白溶液的颜色变化图；图3为用酶标仪检测的带凹孔的平板上用喷墨打印半自动化操作酶联免疫检测不同浓度甲胎蛋白溶液浓度与与吸光度之间的线性关系标准曲线图；图4为拍照后用imageJ检测的带凹孔的平板上用喷墨打印半自动化操作酶联免疫检测不同浓度甲胎蛋白溶液浓度与与吸光度之间的线性关系标准曲线图；图5为用酶标仪检测的标准96孔酶标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：用带有凹孔的平板代替普通酶标板包被抗原/抗体；配置满足打印要求的酶标抗体溶液、显色液和终止液，并添加至墨盒；利用平板喷墨打印机打印添加配置的试剂的方式进行酶联免疫操作；利用照相工具将凹孔内的显色结果转换成可传输的图片形式，其中图片内包括颜色的深浅信息；利用软件对图像进行数据分析，根据分析结果计算得出被测物的含量。

【技术特征摘要】
1.一种基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：用带有凹孔的平板代替普通酶标板包被抗原/抗体；配置满足打印要求的酶标抗体溶液、显色液和终止液，并添加至墨盒；利用平板喷墨打印机打印添加配置的试剂的方式进行酶联免疫操作；利用照相工具将凹孔内的显色结果转换成可传输的图片形式，其中图片内包括颜色的深浅信息；利用软件对图像进行数据分析，根据分析结果计算得出被测物的含量。2.如权利要求1所述的基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：配置满足打印要求的酶标抗体溶液是指：先用直接ELISA法对购买的酶标抗体进行效价，再配置稀释液根据效价将商业购买的酶标抗体进行稀释。3.如权利要求2所述的基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：稀释液的配置方式为：取50μL吐温20、1mL甘油以及0.5g牛血清白蛋白溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液，定容至100mL。4.如权利要求3所述的基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液pH值为7.2。5.如权利要求1所述的基于平板打印的可视化酶联免疫定量检测方法，其特征在于：满足打印要求的显色液配置包括显色液A的配置和显色液B的配...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯波，蒋子欣，许锦，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43