突变丝状菌和使用其制造C4二羧酸的方法技术

本发明专利技术提供一种C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

Mutant filamentous fungi and methods for producing C4 dicarboxylic acid using them

The invention provides a mutant filamentous bacterium with enhanced production capacity of C4 dicarboxylic acid and a method for producing C4 dicarboxylic acid by using the mutant filamentous bacterium. A mutant filamentous fungus in which the expression of at least one of the following polypeptides is enhanced: a polypeptide consisting of an amino acid sequence shown in sequence 2; a polypeptide consisting of an amino acid sequence with at least 90% identity to that shown in sequence 2 and having malate activity; and a deletion, substitution and addition of an amino acid sequence relative to that shown in sequence 2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence with one or more amino acids added or inserted and having malate activity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变丝状菌和使用其制造C4二羧酸的方法
本专利技术涉及突变丝状菌以及使用其制造C4二羧酸的方法。
技术介绍
C4二羧酸除了作为酸化剂、抗菌剂、pH调节剂用于食品工业中的各种用途之外，也可用作合成树脂和可生物降解聚合物的原料，是一种具有高工业价值的物质。C4二羧酸在工业上通过衍生自石化原料的化学合成或通过微生物发酵生产。过去，化学合成因其成本较低而是主流，但近年来，从原料价格上升、环境负担等观点出发，以再生资源作为原料的微生物发酵的制造方法受到关注。已知富马酸是C4二羧酸之一，可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌制造。根霉属菌用葡萄糖作为碳源生产富马酸，并将其排出菌体外。迄今为止，关于使根霉属菌的富马酸高产化的方法，已知有通过改良培养方法和诱变育种来生产高产菌株等。然而，由于根霉属菌的遗传学背景还没有得到充分的研究，通过基因重组开发根霉属菌的富马酸高产技术并不容易，报告也很少。有少量报告，通过将源自酿酒酵母的编码丙酮酸羧化酶的基因导入戴尔根霉(RhizopusDelemar)的方法(专利文献1)、以及将源自大肠杆菌的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因导入米根霉(Rhizopusoryzae)的方法(非专利文献1)以提高富马酸生产能力。苹果酸酶(malicenzyme，ME)是通过与NAD+或NADP+的还原共轭而使苹果酸氧化脱羧，生成丙酮酸和二氧化碳的酶。ME除了存在于大肠杆菌的细胞质中之外，还发现存在于链球菌(Streptococcus)属、念珠菌(Candida)属、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属，棒状杆菌(Corynebacterium)属、以及含油酵母、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)属和高山被孢霉(Mortierellaalpine)属等脂质生产菌中，有报告其参与光合作用、脂质合成、能量代谢等各种代谢通路。在非专利文献2中报告了在导入苹果酸酶基因sfcA的大肠杆菌中，琥珀酸的产生量增加。专利文献2中报告了在敲除了fum基因而使苹果酸酶基因过表达的大肠杆菌中，苹果酸产量增加。另一方面，ME在根霉属菌等丝状菌的代谢通路中的作用仍然未知。现有技术文献：专利文献1：中国专利申请公开第103013843号说明书专利文献2：中国专利第101255405号公报非专利文献1：MetabolicEngineering,2012,14:512-520非专利文献2：Biotech.Bioeng.,2001,74:89-95
技术实现思路
在一个实施方式中，本专利技术提供了一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，本专利技术提供一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括培养上述突变丝状菌的步骤。在另一个实施方式中，本专利技术提供一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括在宿主丝状菌中增强选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。在另一个实施方式中，本专利技术提供一种提高丝状菌中C4二羧酸生产能力的方法，其中，包括在丝状菌中增强中选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。具体实施方式本专利技术涉及C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。本专利技术的专利技术人经过深入研究发现，由给定的氨基酸序列构成且具有苹果酸酶活性的多肽的表达得到增强的丝状菌，其C4二羧酸的生产能力得到提高。本专利技术提供C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。本专利技术的突变丝状菌可用于C4二羧酸的生物学生产。根据使用本专利技术的突变丝状菌生产C4二羧酸的方法，可以高效地生产C4二羧酸。根据以下说明书的描述，本专利技术的上述及其他特征和优点可以更加明确。(1.定义)本说明书中，通过Lipman-Pearson方法(Science,1985,227：1435-1441)计算氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。具体而言，使用遗传信息处理软件GENETYXVer.12的同源性分析程序，通过将Unitsizetocompare(ktup)作为2进行解析并算出。本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％同一性”，是指为90％以上，优选为95％以上，更优选为96％以上，进一步优选为97％以上，更进一步优选为98％以上，更加优选为99％以上的同一性。本说明书中的“缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”，是指1个以上30个以下、优选1以上10个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列。此外，本说明书中的“缺失、取代、添加或插入了一个或多个核苷酸的核苷酸序列”，是指1个以上90个以下、优选1以上30个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下的核苷酸缺失、取代、添加或插入的核苷酸序列。本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加氨基酸或核苷酸。本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”，是指基因转录方向的上游和下游。例如：“位于启动子下游的基因”是指基因存在于DNA有义链的启动子的3’侧，基因的上游是指DNA有义链中该基因的5’侧的区域。本说明书中，调控区域和基因之间的“可操作连接”是指基因和调控区域连接，使得基因可以在该调控区域的调控下表达。基因和调控区域的“可操作连接”的步骤是本领域技术人员公知的。本说明书中，用于微生物的功能、性质和性状的术语“内源”用于表示该功能、性质或性状存在于该微生物的野生型中。相反，术语“外源”表示不是最初存在于微生物中，而是从外部导入的功能、性质和性状。例如，“外源”基因或多核苷酸是指从微生物的外部导入的基因或多核苷酸。外源基因或多核苷酸可以来自与其所导入的微生物同种的生物，也可以来自异源生物(即异源基因或多核苷酸)。本说明书中，微生物的“C4二羧酸生产能力”表示该微生物的培养基中C4二羧酸的生成速度，更具体而言，表示该微生物培养开始后经过一定时间后，将由微生物产生的C4二羧酸的每单位体积培养基的质量除以培养时间而得到的值(g/L/h)。微生物的C4二羧酸的产生量可以作为从该微生物的培养物中除去细胞而得到的培养上清液中的C4二羧酸的量而算出。培养上清液中的C4二羧酸的量可以通过高效液相色谱(HPLC)等测定。在后述的参考例1中例示了更具体的测定步骤。本说明书中，突变体中“C4二羧酸的产生能力提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.15 JP 2016-1806271.一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。2.如权利要求1所述的突变丝状菌，其中，导入了含有选自以下的至少一种多核苷酸的DNA片段或载体：由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列构成、并且编码具有苹果酸酶活性的多肽的多核苷酸；以及由相对于序列号1所示的核苷酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个核苷酸的核苷酸序列构成、并且编码具有苹果酸酶活性的多肽的多核苷酸。3.如权利要求1或2所述的突变丝状菌，其中，所述丝状菌是根霉属菌。4.一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括培养权利要求1～3中任一项所述的突变丝状菌的步骤。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：野中镜士朗，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP