一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的为肌醇缺陷型菌株。本发明专利技术还涉及一种肌醇缺陷型菌株在食品中肌醇测定的方法，其包括配制肌醇缺陷型菌株悬液；配制肌醇标准溶液，以进行标准曲线的制作；处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在待测样品溶液中加入肌醇缺陷型菌株悬液，以根据标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。本发明专利技术成功筛选到一株肌醇缺陷型菌株，进一步利用该菌建立了一种食品中肌醇含量测定的微生物方法，该测定方法具有良好的精密度，回收率及重现性。

A Screening Method for Inositol Deficient Strains and Its Application

The present invention relates to a screening method for inositol-deficient strains. The strains to be screened are activated to prepare inoculation suspension and placed in the culture system containing inositol and inositol respectively. The growth specificity of the strains is judged by real-time detection with enzyme label instrument, and the strains that do not obviously grow in the culture system without inositol are inositol-deficient strains. The invention also relates to a method for determination of inositol in food by inositol-deficient strains, including preparation of suspension of inositol-deficient strains, preparation of inositol standard solution for making standard curves, treatment of samples to be tested for preparing sample solution, and addition of inositol-deficient strain suspension in sample solution to be tested for carrying out test samples according to standard curves. Determination of inositol content. A strain of inositol-deficient strain was successfully screened by the invention, and a microbial method for the determination of inositol content in food was established by using the strain. The method has good precision, recovery and reproducibility.

【技术实现步骤摘要】
一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其应用
本专利技术属于菌种筛选及食品中维生素测定
，具体涉及一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法及其在测定食品中肌醇含量的应用。
技术介绍
肌醇又称环己六醇，是一种具有生物活性的环状糖醇。1850年BeckettC等首次从动物组织抽提液中发现了肌醇。1940年Wooley.D.首次发现该抽提液中制得的肌醇具有抗脱毛作用，从而揭开了肌醇具有维生素活性这一特性。随着有关肌醇研究的深入，研究者发现肌醇理论上具有9种立体异构体，其中内消旋(1,2,3,5-顺式)环己醇具有维生素生物活性。近年来，随着对肌醇研究的逐步深入，研究者发现肌醇具有诸多生理活性，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。在饲料工业中，由于肌醇作为生物促进剂，在动物快速生长期，能够刺激机体加速生长及防止动物死亡，因此作为养殖业饲料必需的添加成分。在食品工业中，由于肌醇对人的多类型的细胞的生长是必须的，因此常作为营养强化剂添加于婴幼儿食品及保健食品中。在医药工业中，肌醇失衡被证实与阿尔茨海默病、双向性精神障碍、癫痫等神经退行性疾病相关，肌醇还可改善多囊卵巢综合症女性的胰岛素敏感性和排卵功能，治疗女性代谢疾病。此外，肌醇是氟代肌醇、脉通等药物的中间体，在治疗肿瘤、动脉粥样硬化等方面有较好的疗效，近年来肌醇也作为脂肪肝等疾病的辅助治疗药物。肌醇广泛分布于自然界的动植物体内，特别是全谷物和柑橘类水果内，作为一种营养强化剂，常被添加于婴幼儿配方乳粉及特殊膳食食品中。目前，国内外有关肌醇检测的方法主要有色谱法(气相色谱法、GC-MS法、HPLC法、GC-MS法、离子色谱法)和微生物法。其中色谱法主要适用于含量较高，基质成分简单的强化食品中肌醇的测定；而微生物法基于其高灵敏度，更适合于基质复杂，含量较低的天然食品中级肌醇的测定。根据文献报道，肌醇是酵母菌的生长因子，对于酵母菌的生长是必需的，但是有些酵母菌自身能够合成细胞生长所需的肌醇，有些酵母菌却是天然的肌醇缺陷型，必需依赖培养基中的外源肌醇。但目前，现有用于肌醇测定的菌株肌醇依赖性不强，属于弱缺陷性菌株，肌醇测定的结果不可靠。
技术实现思路
为了解决现有技术的缺陷，本专利技术基于特殊酵母菌的特性，筛选肌醇缺陷型酵母菌，并在GB5009.270-2016《食品安全国家标准食品中肌醇的测定》微生物法的基础上，进行优化改良，从而获得更可靠稳定的用于肌醇测定的微生物方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其包括如下步骤：将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。在不含肌醇的培养体系中，其吸光度应小于等于0.1。为了进一步优化上述筛选方法，本专利技术还采取如下技术措施：进一步地，接种菌悬液的制备步骤如下：将菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得接种菌悬液。进一步地，所述含有肌醇的培养体系中的肌醇浓度为1～10μg/mL。更优选为1μg/mL。进一步地，所述待测菌种包括酿酒酵母菌和葡萄汁酵母菌；所述肌醇缺陷型菌株包括酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249和葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。进一步地，所述筛选方法还包括步骤：对所述肌醇缺陷型菌的培养时间、测定准确率、培养终点进行验证，以确定用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌；其中，所述用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌为酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249和葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465，更优选为葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。进一步地，用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌在培养至终点时间隔2h测定吸光度；其中，连续两次吸光度的差值在0.05之内，终止培养。本专利技术的第二个目的是提供一种肌醇缺陷型菌株，所述菌株为酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249或葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465，更优选为葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。本专利技术的第三目的是酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249或葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465在测定食品中肌醇含量的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种利用上述肌醇缺陷型菌株以用于食品中肌醇的测定方法，其包括以下步骤：步骤1)配制肌醇缺陷型菌株悬液；步骤2)配制肌醇标准溶液，以用于配制标准曲线用溶液，并在所述标准曲线用溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以进行标准曲线的制作；步骤3)处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在所述待测样品溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以根据所述标准曲线进行待测样品中肌醇含量的测定。为了进一步优化上述测定方法，本专利技术还采取如下技术措施：进一步地，所述肌醇缺陷型菌株悬液的配制步骤包括：将肌醇缺陷型菌株活化后接种到培养基上，培养2～3天后，制成贮备菌种，贮于冰箱中；在使用的前一天将贮备菌种转接到培养基中，培养20h～24h；取培养基培养物，在无菌条件下离心，倾去上清液；加入已灭菌的生理盐水重新分散细胞，快速混合均匀，离心倾去上清液；重复离心和清洗步骤后，细胞分散液用生理盐水悬浮，制成混悬液；550nm波长下测定所述混悬液的透光率，调整加入的菌液量或者氯化钠溶液使所述混悬液透光率在60％～80％，获得肌醇缺陷型菌株悬液。进一步地，所述肌醇标准溶液的配制步骤包括：取肌醇标准品干燥24h以上，称取预定量的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至预定容量的棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得预定浓度的肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。更进一步地，取肌醇标准品干燥24h以上，称取50mg的肌醇标准品，用水充分溶解，定容至250mL棕色容量瓶中，贮存在冰箱中，获得肌醇标准储备液；并采用所述肌醇标准储备液配制肌醇标准中间液和肌醇标准工作液。进一步地，肌醇标准品储备液中肌醇的浓度为0.2mg/mL，肌醇标准中间液肌醇的浓度为10μg/mL，肌醇标准工作液肌醇的浓度为1μg/mL和2μg/mL。进一步地，所述肌醇标准工作液需每次临用前配制。进一步地，所述待测样品的处理步骤包括：称取预定量的样品，加入盐酸溶液，混匀；在灭菌釜中水解；取出，冷却至室温，加入氢氧化钠溶液，冷却；用适宜浓度的氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH至4.5～6，定容，混匀，过滤，收集滤液，，调整稀释度，使待测液肌醇浓度于0.1μg/mL～1μg/mL，作为试样提取液。更进一步地，所述pH为5.2±0.1，采用水定容至250mL。进一步地，所述待测样品经过预处理，其包括：薏米、乳粉样品粉碎、研磨、过筛；肉样品用打碎机制成食糜；南瓜、猕猴桃样品匀浆混匀；饮料样品用前振摇混合。进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。

【技术特征摘要】
1.一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：将待筛选菌种活化后制备接种菌悬液，并将所述接种菌悬液分别置于含有肌醇和不含肌醇的培养体系中，采用酶标仪实时检测，判断菌种的生长特异性，在不含肌醇的培养体系中无明显生长的菌株为肌醇缺陷型菌株。2.根据权利要求1所述的肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，所述含有肌醇的培养体系中的肌醇浓度为1～10μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，所述待筛选菌种包括酿酒酵母菌和葡萄汁酵母菌；所述肌醇缺陷型菌株包括酿酒酵母S.cerevisiaeCICC32249和葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。4.根据权利要求3所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，还包括步骤：对所述肌醇缺陷型菌株的培养时间、测定准确率、培养终点进行验证，以确定用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株；其中，所述用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株为葡萄汁酵母S.uvarumCICC1465。5.根据权利要求4所述的一种肌醇缺陷型菌株的筛选方法，其特征在于，用于肌醇测定的肌醇缺陷型菌株在培养至终点时间隔2h测定吸光度；其中，连续两次吸光度的差值在0.05之内，终止培养。6.一种权利要求1～5中任一项所筛选的肌醇缺陷型菌株在测定食品中肌醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)配制肌醇缺陷型菌株悬液；步骤2)配制肌醇标准溶液，以用于配制标准曲线用溶液，并在所述标准曲线用溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液，以进行标准曲线的制作；步骤3)处理待测样品，以用于配制待测样品溶液，并在所述待测样品溶液中加入所述肌醇缺陷型菌株悬液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，范迪，范一灵，杨燕，闻宏亮，秦峰，刘浩，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海,31