一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法技术

本发明专利技术涉及降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，有效解决肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A的干扰，达到治疗肝癌用药的问题。方法是，构建慢病毒MAT2A干扰载体，将慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA包装，重组慢病毒pLentiH1‑MAT2AshRNA滴度测定，计算病毒滴度；pLentiH1‑MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测，干扰载体MAT2A‑shRNA2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测，脂滴聚积能力在sh‑MAT2A处理组中降低48‑52%。本发明专利技术方法易操作、灵敏，稳定可靠，能显著降低脂肪细胞中MAT2A mRNA和蛋白的表达水平，且脂肪细胞中脂质含量水平也明显下降，实现对猪肌内脂肪细胞脂质沉积的干扰作用。

Preparation of Mat2A Gene Interference Vector for Reducing Lipid Deposition in Intramuscular Adipocytes

The invention relates to a preparation method of a gene interference vector for reducing lipid deposition of intramuscular adipocytes MAT2A, which effectively solves the interference of lipid deposition of intramuscular adipocytes MAT2A and achieves the problem of medication for treating hepatocellular carcinoma. Methods: lentivirus MAT2A interference vector was constructed, lentivirus MAT2A interference vector was transfected into the medium containing 293T vector containing lentivirus vector, the recombinant lentivirus pLentiH1 MAT2AshRNA MAT2AshRNA was packaged, recombinant lentivirus pLentiH1 MAT2AshRNA MAT2AshRNA titer was determined, virus titer was calculated, pLentiH1 fat MAT2AshRNA was detected in pig intramuscular adipocytes, interference vector MAT2A shRNA2 shRNA2 on pigs. Detection of lipid deposition in intramuscular adipocyte differentiation showed that lipid accumulation decreased by 48.52% in sh_MAT2A treatment group. The method is easy to operate, sensitive, stable and reliable, and can significantly reduce the expression level of MAT2A mRNA and protein in adipocytes, and the level of lipid in adipocytes is also significantly reduced, thus achieving the interference effect on lipid deposition of intramuscular adipocytes in pigs.

【技术实现步骤摘要】
一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法
本专利技术涉及医药
，特别是一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法。
技术介绍
慢病毒载体作为一个高效实用的基因转移工具，其在基础和应用研究领域已得到广泛认可。RNAi是可以抑制正常生物体内特定基因表达的一种工具，在进化过程中高度保守，由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发目的mRNA高效特异性降解的现象，其利用RNA介导，可特异性地阻断和降低目的基因。慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体，可感染分裂期和非分裂期细胞，其感染效率高。利用RNA介导，可特异性地阻断和降低目的基因的表达，同时载体感染细胞的范围扩大，外源的short-hairpinRNAs(shRNAs)既可用于细胞特定基因功能的研究，还可用于基因治疗。研究表明哺乳动物有两种形式的腺苷甲硫氨酸转移酶，一种是肝脏特异性的MAT1A，编码MATI/III；再一种是非肝脏特异性的MAT2A，编码MATII。另外一个基因—MAT2B，编码β调控亚基，与MAT2A编码的α2催化亚基一起调控MATII的酶活性。MATI/III主要在肝脏细胞中表达并维持着这些细胞的分化状态；MATII在所有的肝外细胞中表达，在正常的肝细胞中检测不到其表达，但是在肝癌细胞的激活或去分化状态时能够被激活。在肝癌细胞中，c-Myb,Sp1,NF-κB和AP-1等转录因子能够促进MAT2A启动子的转录，同时MAT2A的表达能够响应于TNF-α的处理。MAT2A作为MafK的一个转录抑制子与染色质调控基因一起为SAMe提供甲基转移酶。除此之外，在人类的结肠癌和肝癌细胞中，MATα2泛素化可以正向的调控Bal-2的表达。在大鼠的肝癌细胞中，PPARγ负调控处于静息状态肝癌细胞时的MAT2A基因表达，但是在由静息状态转向激活状态时，则可以上调MAT2A基因的表达。同时，MAT2A能特定地与H3K9甲基转移酶SETDB1互作以及结合MAT2B促进COX-2基因位点的H3K9三甲基化而抑制COX-2基因表达。先前研究采用基因芯片技术发现MAT2B与猪肌内脂肪含量密切相关，其在脂肪型猪和瘦肉型猪的脂肪和肌肉组织中存在着显著的差异表达，推测可能影响猪肌内脂肪沉积。目前关于MAT2A基因的研究层面主要集中在癌细胞等方面，在脂肪细胞分化及其调控机制方面并未有相关报道。本研究通过构建MAT2A基因的慢病毒干扰载体，达到降低肌内脂肪细胞脂质沉积，为进一步研究MAT2A调控脂肪细胞分化及分子机理实现治疗肝癌的用药垫定技术基础。
技术实现思路
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术的目的就是提供一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，可有效解决肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A的干扰，达到治疗肝癌用药的问题。本专利技术解决的技术方案是，一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，包括以下步骤：（1）慢病毒MAT2A干扰载体的构建：根据GenBank中猪MAT2A基因序列，利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTMRNAiDesigner分别筛选3条shRNA靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为MAT2A-sh1、MAT2A-sh2、MAT2A-sh3、Sh-scramble（Sh-scramble是实验对照序列；对照序列对任何基因起不到干扰作用，实验有处理，就必须有对照，也就是比较的对象；把sh-scramble也转入细胞中，目的是所有的处理都处在同样的水平之下），与经过BamHI和XhoI(TaKaRa)双酶切后的pLenti-H1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒MAT2A干扰载体；（2）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装：将步骤（1）制备的慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装，方法是：对细胞密度为85-95%的293T细胞置入新鲜的培养基中2-4h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.5gDMEM干粉（DMEM是dulbecco'smodifiedeaglemedium的缩写）、胎牛血清10mL（均购买于美国Gbico公司），0.22gNaHCO3，0.26gHepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：A液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒MAT2A干扰载体+7.5μgΔ8.9+5μgVSVG（VSVG是一种包膜蛋白，病毒正是通过包膜蛋白与宿主细胞识别，然后进入细胞，全称是疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G，以下同）溶解在1.5mL无血清无双抗DMEM培养基中（无血清无双抗DMEM培养基简称为Opti-DMEM培养基，以下同），混匀，所述的无血清无双抗DMEM培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.4-0.6gDMEM干粉（购买于美国Gbico公司），0.18-0.26gNaHCO3，0.2-0.3gHepes，混匀制得；B液，为溶解有脂质体的溶液：由30-40μlX-tremeGENEHPDNA溶解在1-2mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀制得；将A液和B液，分别室温静置4-6min，混合均匀，再室温静置18-22min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，20-30h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于1800-2200rpm离心8-12min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液；（3）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液过0.4-0.5μm滤膜，用80000-120000r·min-1离心25-35min得到浓缩的病毒颗粒；按照8-12倍体积比用水稀释病毒，以10-2～10-6浓度梯度分别感染293T细胞，每个梯度3个重复，35-40℃、置于体积为5%的CO2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·mL-1）=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01mL，计算病毒滴度；4）pLentiH1-MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用pLentiH1-MAT2A-shRNA慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达，当细胞中都有GFP表达时（说明病毒侵染效率较高），分别收集脂肪细胞的RNA和蛋白，利用Realtime-PCR和Westernblot检测MAT2A-shRNA的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中MAT2A-shRNA1、MAT2A-shRNA2、MAT2A-shRNA3的mRNA干扰效率分别是45％、70％和55％，收集MAT2A-shRNA2的干扰载体（MAT2A-shRNA2干扰效率最高，所以MAT2A-shRNA2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）慢病毒MAT2A干扰载体的构建：根据GenBank中猪MAT2A基因序列，利用Invitrogen公司在线软件BLOCK‑iT

【技术特征摘要】
1.一种降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）慢病毒MAT2A干扰载体的构建：根据GenBank中猪MAT2A基因序列，利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTMRNAiDesigner分别筛选3条shRNA靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为MAT2A-sh1、MAT2A-sh2、MAT2A-sh3、Sh-scramble，与经过BamHI和XhoI(TaKaRa)双酶切后的pLenti-H1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒MAT2A干扰载体；（2）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装：将步骤（1）制备的慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装，方法是：对细胞密度为85-95%的293T细胞置入新鲜的培养基中2-4h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.5gDMEM干粉、胎牛血清10mL，0.22gNaHCO3，0.26gHepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：A液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒MAT2A干扰载体+7.5μgΔ8.9+5μgVSVG溶解在1.5mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀，所述的无血清无双抗DMEM培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.4-0.6gDMEM干粉，0.18-0.26gNaHCO3，0.2-0.3gHepes，混匀制得；B液，为溶解有脂质体的溶液：由30-40μlX-tremeGENEHPDNA溶解在1-2mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀制得；将A液和B液，分别室温静置4-6min，混合均匀，再室温静置18-22min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，20-30h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于1800-2200rpm离心8-12min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液；（3）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液过0.4-0.5μm滤膜，用80000-120000r·min-1离心25-35min得到浓缩的病毒颗粒；按照8-12倍体积比用水稀释病毒，以10-2～10-6浓度梯度分别感染293T细胞，每个梯度3个重复，35-40℃、置于体积为5%的CO2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·mL-1）=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01mL，计算病毒滴度；4）pLentiH1-MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用pLentiH1-MAT2A-shRNA慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达，当细胞中都有GFP表达时，分别收集脂肪细胞的RNA和蛋白，利用Realtime-PCR和Westernblot检测MAT2A-shRNA的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中MAT2A-shRNA1、MAT2A-shRNA2、MAT2A-shRNA3的mRNA干扰效率分别是45％、70％和55％，收集MAT2A-shRNA2的干扰载体；5）干扰载体MAT2A-shRNA2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：pLentiH1-MAT2A-shRNA侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红O检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-MAT2A处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的MAT2A基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的MAT2A基因干扰载体。2.根据权利要求1所述的降低肌内脂肪细胞脂质沉积MAT2A基因干扰载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）慢病毒MAT2A干扰载体的构建：根据GenBank中猪MAT2A基因序列，利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTMRNAiDesigner分别筛选3条shRNA靶序列和无关对照序列，将合成的单链寡核苷酸退火形成双链，分别命名为MAT2A-sh1、MAT2A-sh2、MAT2A-sh3、Sh-scramble，与经过BamHI和XhoI(TaKaRa)双酶切后的pLenti-H1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆提取质粒，酶切鉴定正确后，进行测序鉴定，确保插入载体的目标序列与设计合成的靶基因序列一致，得慢病毒MAT2A干扰载体；（2）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装：将步骤（1）制备的慢病毒MAT2A干扰载体转染到含有慢病毒载体的293T细胞的培养基中，对重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA包装，方法是：对细胞密度为90%的293T细胞置入新鲜的培养基中3h，以使细胞适应，所述的培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.5gDMEM干粉，胎牛血清10mL，0.22gNaHCO3，0.26gHepes；然后进行转染，转染时，先配置两种液体：A液，为溶解有质粒的溶液，由步骤（1）制备的10μg慢病毒MAT2A干扰载体+7.5μgΔ8.9+5μgVSVG溶解在1.5mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀，所述的无血清无双抗DMEM培养基为每100mLPBS缓冲液中含0.5gDMEM干粉，0.22gNaHCO3，0.26gHepes，混匀制得；B液，为溶解有脂质体的溶液：由35μlX-tremeGENEHPDNA溶解在1.5mL无血清无双抗DMEM培养基中，混匀制得；将A液和B液，分别室温静置5min，混合均匀，再室温静置20min，均匀滴加到培养皿中，轻微震荡，放培养箱培养，24h观察荧光蛋白表达情况，48h和72h时分别收集上清液；将收集的病毒上清液于2000rpm离心10min去除细胞碎片，即得包装的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液；（3）重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA滴度测定：将步骤（2）制备的重组慢病毒pLentiH1-MAT2AshRNA上清液过0.45μm滤膜，用100000r·min-1离心30min得到浓缩的病毒颗粒；按照10倍体积比用水稀释病毒，以10-4浓度梯度分别感染293T细胞，每个梯度3个重复，37℃、置于体积为5%的CO2培养箱培养48h，统计绿色荧光表达情况，每孔统计5个视野下的荧光数，按公式：病毒滴度（pfu·mL-1）=GFP阳性细胞数×病毒稀释倍数÷0.01mL，计算病毒滴度；4）pLentiH1-MAT2AshRNA侵染猪肌内脂肪细胞的检测：用pLentiH1-MAT2A-shRNA慢病毒分别侵染猪肌内脂肪细胞48h，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达，当细胞中都有GFP表达时，分别收集脂肪细胞的RNA和蛋白，利用Realtime-PCR和Westernblot检测MAT2A-shRNA的干扰效率，与sh-scramble阴性对照相比，在脂肪细胞中MAT2A-shRNA1、MAT2A-shRNA2、MAT2A-shRNA3的mRNA干扰效率分别是45％、70％和55％，收集MAT2A-shRNA2的干扰载体；5）干扰载体MAT2A-shRNA2对猪肌内脂肪细胞分化脂质沉积的检测：pLentiH1-MAT2A-shRNA侵染猪肌内前体脂肪细胞48h后，分化培养基诱导成脂分化8天至成熟，油红O检测脂质积累情况，与sh-scramble对照组相比，脂滴聚积能力在sh-MAT2A处理组中显著降低，达48-52%，即为慢病毒介导的MAT2A基因干扰显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质沉积的MAT2A基因干扰...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵存真，郭晓秋，刘佳，陈斌，王俊峰，
申请(专利权)人：信阳农林学院，
类型：发明
国别省市：河南,41