一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用，其中生淀粉水解酶名称为AmyZ1，其氨基酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQ ID No：2；(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。本发明专利技术生淀粉水解酶来自海洋细菌Pontibacillus sp.ZY，具有高比酶活力，其对生淀粉及可溶性淀粉均具有高比酶活；且可于较低温度条件下，高效水解20‑30％的高浓度生淀粉，具有潜在应用价值。

A Raw Amylolytic Enzyme with High Specific Enzyme Activity, Its Coding Gene and Its Application

The invention discloses a raw starch hydrolase with high specific enzyme activity, its coding gene and application, in which the name of raw starch hydrolase is AmyZ1, and its amino acid sequence is one of the following sequences: (1) SEQ ID No:2 in the sequence table; (2) SEQ ID No:2 in the sequence table has been replaced, deleted or added with one or more amino residues and encodes the same functional protein. Base acid sequence. The raw starch hydrolase of the invention is derived from marine bacteria Pontibacillus sp.ZY and has high specific enzyme activity for raw starch and soluble starch, and can hydrolyze 20 30% high concentration raw starch efficiently at low temperature, which has potential application value.

【技术实现步骤摘要】
一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用
本专利技术涉及一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用，属于生物

技术介绍
α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1)可作用于淀粉、多糖及寡糖内部的α-1,4-葡萄糖苷键，产生α-异头物构型保留的低聚麦芽糖和葡糖糖。α-淀粉酶在淀粉转换成低聚糖的过程中起着非常重要的作用，因此对于以淀粉作为基本能量来源的有机体来说是至关重要的。另外，α-淀粉酶是苷水解酶类中一类重要的工业用酶，其被广泛应用于食品加工、污水处理、制药工业、酿酒工业、新型生物能源应用方面。淀粉是一种廉价的能源物质，已广泛用于工业生产中。传统的淀粉降解主要包括淀粉糊化和淀粉酶解两个步骤。天然的生淀粉颗粒不能被普通的淀粉降解酶直接降解，只有通过高温糊化破坏生淀粉颗粒的结构，促使生淀粉变为熟淀粉，淀粉长链才能被淀粉降解酶有效切断。酶促淀粉转化的传统过程需要高能量输入并导致淀粉基产品的成本增加。为了节省能量和成本，能够在较低温度下水解高浓度生淀粉的α-淀粉酶引起了越来越多的关注。在已发现的α-淀粉酶中，只有不足10％的酶具有降解生淀粉的能力。此类酶直接作用不经糊化的生淀粉，可有效的简化现代发酵工业中的生淀粉的前期处理过程。至今，已从Bacillussp.，Aspergillussp.，Geobacillussp.和Rhizopussp.等种属微生物中发现了具备生淀粉水解能力的α-淀粉酶，能有效的降解小麦、玉米、马铃薯等生淀粉，但水解生淀粉的反应多在60℃以上高温条件下进行，或者通过延长反应时间以提高水解率。本专利技术AmyZ1淀粉酶能够在30～35℃水解20～30％底物浓度的生淀粉，反应4h后，大米、玉米、小麦等的水解率可达到37％以上，十分高效节能，具有潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供了一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶、其编码基因及其应用。本专利技术具有高比酶活力的生淀粉水解酶，名称为AmyZ1，为海洋细菌来源，其原始来源于中国南海永兴岛针叶藻海底沉积物样品中筛选的Pontibacillussp.ZY菌株，其氨基酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：2；(2)序列表中的SEQIDNo：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。编码所述生淀粉水解酶的基因，其核苷酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：1；(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的多核苷酸序列。含有所述生淀粉水解酶基因并能产生所述生淀粉水解酶的菌株，名称为EscherichiacoliBL21(DE3)/pET22b(+)-amyZ1，由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号CCTCCNO：M2018893，保藏日期为2018年12月13日。本专利技术生淀粉水解酶的重组表达菌株的构建方法，包括如下步骤：以包含具有高比酶活力的生淀粉水解酶基因的Pontibacillussp.ZY细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并与pEASY-T3质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有生淀粉水解酶基因的pEASY-T3重组质粒，用NdeI和XhoI双酶切所得的pEASY-T3重组质粒和表达质粒载体，然后用T4DNA连接酶将酶切后的amyZ1与表达质粒载体连接，得到连接产物；将得到的连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，即可得到含有本专利技术生淀粉水解酶基因的工程菌株。所述引物为：P1：5’-CATATGYTNGGNATNWSNTTYGTNYTN-3’P2：5’-CTCGAGYTTYTGYTTRTANACNSWNACNSW-3’所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。所述宿主菌是指E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、E.coliJM109或E.coliRosetta等。下面以表达质粒载体pET22b(+)、E.coliBL21(DE3)为例，介绍含有本专利技术海洋细菌淀粉酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤：1、以包含海洋细菌来源、具有高比酶活力的生淀粉水解酶基因的Pontibacillussp.ZY细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述引物为：P1：5’-CATATGYTNGGNATNWSNTTYGTNYTN-3’P2：5’-CTCGAGYTTYTGYTTRTANACNSWNACNSW-3’2、将步骤1所得PCR扩增产物和pEASY-T3质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有本专利技术生淀粉水解酶基因的pEASY-T3重组质粒；3、用NdeI和XhoI双酶切步骤2所得的pEASY-T3重组质粒和pET22b(+)质粒，然后用T4DNA连接酶将酶切后的amyZ1与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本专利技术生淀粉水解酶基因的工程菌株EscherichiacoliBL21(DE3)/pET22b(+)-amyZ1。本专利技术生淀粉水解酶的应用，是用于生淀粉的水解，其对生淀粉及可溶性淀粉均具有高比酶活；且可于较低温度条件下，高效水解20-30％的高浓度生淀粉。本专利技术生淀粉水解酶的应用，是在所述生淀粉水解酶的存在下对生淀粉进行水解。水解体系为pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入终浓度为1mM的CaCl2，随后加入生淀粉，以及所述生淀粉水解酶，30-35℃、150rpm摇床水浴下进行水解反应。水解温度优选为30℃，水解时间为2-4小时。所述生淀粉包括大米、玉米、小麦等中的一种或几种，添加浓度为20-30％(w/v)。所述生淀粉水解酶的添加比例为1-5U/mg生淀粉。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：1、本专利技术海洋细菌淀粉酶基因来自于海洋细菌Pontibacillussp.ZY；2、本专利技术海洋细菌淀粉酶在pH5.5-7.5范围内具有良好的稳定性，30℃条件下半衰期为15小时；3、本专利技术具有高比酶活力的生淀粉水解酶可于低温下，高效水解20-30％的高浓度生淀粉，反应体系在30-35℃、150rpm摇床水浴锅中反应4h，大米、玉米、小麦的水解率均到达37％以上，因此具有潜在应用价值。附图说明图1为本专利技术AmyZ1PCR扩增产物的电泳图谱。其中M为分子量标准；1为AmyZ1PCR扩增产物。图2为本专利技术表达载体pET22b(+)/AmyZ1质粒的鉴定电泳图谱。图2中M为分子量标准；2、3为经过NdeI/XhoI双酶切的pET22b(+)/AmyZ1；4、5为经过NdeI/XhoI双酶切的pET22b(+)。图3为以大米为底物时测定的本专利技术AmyZ1催化的最适温度、最适pH。图3中a为最适pH；b为最适温度。图4为以大米为底物时测定的不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶，其特征在于：所述生淀粉水解酶，名称为AmyZ1，其氨基酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQ ID No：2；(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种具有高比酶活力的生淀粉水解酶，其特征在于：所述生淀粉水解酶，名称为AmyZ1，其氨基酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：2；(2)序列表中的SEQIDNo：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的生淀粉水解酶的基因，其特征在于其核苷酸序列为如下序列中的一种：(1)序列表中的SEQIDNo：1；(2)序列表中的SEQIDNo：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQIDNo：2蛋白质序列的多核苷酸序列。3.含有权利要求1所述的生淀粉水解酶基因并能产生所述生淀粉水解酶的重组表达菌株，其特征在于：所述重组表达菌株的名称为EscherichiacoliBL21(DE3)/pET22b(+)-amyZ1，由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号CCTCCNO：M2018893，保藏日期为2018年12月13日。4.权利要求3所述的重组表达菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：以包含具有高比酶活力的生淀粉水解酶基因的Pontibacillussp.ZY细菌基因组DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并与pEASY-T3质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚中，房伟，薛赛赛，方泽民，刘娟娟，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34