一种大量扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种大量扩增NK细胞的方法，属于生物技术领域，首先制备外周血单个核细胞，然后将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养3d后，用含有IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2‑3×10

A method of amplifying NK cells in large quantities

The present invention relates to a method for amplifying NK cells in large quantities, which belongs to the field of biotechnology. First, peripheral blood mononuclear cells are prepared. Then, peripheral blood mononuclear cells are inoculated into a medium containing RetroNectin, Merovir antibody, mouse anti-human CD161 antibody, IL_2, IL_15, IL_18 and autologous plasma. After 3 days of culture, the cells are cultured under the condition of 37 C and 5% CO2, and then cultured with IL_2, IL_15. Medium of IL-18 and autologous plasma regulates cell density to 2 3 10

【技术实现步骤摘要】
一种大量扩增NK细胞的方法
本专利技术涉及一种大量扩增NK细胞的方法，属于生物

技术介绍
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫淋巴细胞的关键子集，是天然免疫的重要组成部分，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。NK细胞占外周血淋巴细胞的10％-15％，可以向外周组织和次级淋巴器官(SLO)迁移，或者在外周血和SLO之间形成再循环。通过这种再循环方式，NK细胞可以巡视身体，并在特定的地点遇到不同的免疫细胞，发生调节作用。目前的培养体系是能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。重组细胞因子IL-2和IL-15可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增几十倍，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。虽然目前有很多改进NK细胞扩增培养的方法，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高等问题。RetroNectin属于重组人纤维连接蛋白片段(FN)，它含有人纤维连接蛋白CS-1位点和centralcell-bindingdomain，分子量约为63K，其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-1site及centralcell-bindingdomain可与T细胞表面的VLA结合，从而刺激细胞大量繁殖。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中无法扩增更大数量NK细胞的问题，提供一种大量扩增NK细胞的方法，该方法可以获得更高数量的NK细胞以供临床回输。本专利技术所采用的技术方案是：一种大量扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：(1)收集血浆：取外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；(2)制备外周血单个核细胞：用生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离并用生理盐水洗涤后，获得外周血单个核细胞；(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO2的条件下进行培养；(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养2-4d后，用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×106个细胞/mL，37℃、5％CO2的条件下培养10-16d，即得大量的NK细胞。进一步，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。进一步，步骤(1)中，两次离心的转速均为2000-3000rpm，离心时间均为8-10min。进一步，步骤(3)中，所述培养基的组成为：20-100μg/mLRetroNectin、50-250ng/mL美罗华抗体、0.5-5μg/mL鼠抗人CD161抗体、100-1000U/mLIL-2、1-20ng/mLIL-15、1-10ng/mLIL-18和5-10v％自体血浆。进一步，步骤(3)中，所述接种量为：外周血单个核细胞在培养基里的细胞密度为2-5×106个细胞/mL。进一步，步骤(4)中，所述培养基的组成为：100-1000U/mLIL-2、1-10ng/mLIL-15、1-10ng/mLIL-18和5-10％自体血浆。进一步，步骤(4)中，培养期间，每2d根据细胞密度0.8-1×106个/mL进行补液。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种体外诱导扩增大量NK细胞的方法，操作简单，容易实现，该方法扩增效率高，可以获得更高数量的NK细胞以供临床回输，并且细胞纯度高。附图说明图1为人外周血淋巴细胞中NK细胞比例的流式细胞术检测结果；图2是采用实施例1方法扩增后的NK细胞比例的流式细胞术检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。下述实施例中，Retronectin为宝生物工程(大连)有限公司生产，美罗华抗体为上海罗氏制药有限公司生产，鼠抗人CD161抗体和IL-2、IL-15、IL-18均为德国美天旎生物技术有限公司生产，但均不限于此。实施例1一种大量扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：(1)收集血浆：用含有肝素抗凝剂的采血管采集20mL人外周血(留取0.5mL用于流式检测)，经2500rpm离心10min后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆移至新的50mL无菌离心管中，56℃灭活30min，然后2500rpm离心10min，收集上清，用于后续细胞培养；(2)制备外周血单个核细胞：用30mL生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，将细胞悬液缓慢注入预先装有15mL人淋巴细胞分离液的50mL离心管中，然后2200rpm室温离心25min，轻轻吸取分离界面乳白色细胞层，分装到4个50mL无菌离心管中，以生理盐水加至50mL，混匀后，2000rpm离心10min，弃上清，收集细胞沉淀，用PBS洗涤2遍后，得到外周血单个核细胞；(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin(25μg/mL)、美罗华抗体(50ng/mL)、鼠抗人CD161抗体(1μg/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-15(5ng/mL)、IL-18(5ng/mL)和自体血浆(10％)的培养基中，用该培养基调整细胞密度至2×106个细胞/mL，37℃、5％CO2的条件下培养3d；(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养3d后，用含有IL-2(200U/mL)、IL-15(5ng/mL)、IL-18(5ng/mL)和自体血浆(5％)的培养基调整细胞密度至2×106个细胞/mL，每2d取样计数按细胞密度0.8-1*106个/mL进行调整补液，37℃、5％CO2的条件下培养16d，即得大量的NK细胞。对比例1将实施例1步骤(3)中的培养基中的组分RetroNectin去掉，其余与实施例1相同。实验测试：1.细胞计数取实施例及对比例中培养前(D0)及培养第10d(D10)、14d(D14)、16d(D16)培养的细胞，PBS稀释40倍，然后取10μl加入到血细胞计数板中，在显微镜下计数，并以“细胞总数÷4×稀释倍数×液体总量”公式计算细胞数，经计算，得出的细胞数见表1：表1对比例1实施例1D04.05*1064.05*106D1023.46*10637.74*106D1458.3*1061.59*108D1675.9*1063.2*1082.流式细胞术检测外周血NK细胞的表达取150μl实施例1的步骤(1)中留取的外周血，加入流式管中，加入不同荧光标记的鼠抗人CD3和CD56抗体各2μl，室温孵育15min，加入2mL红细胞裂解液，室温孵育并间歇震荡5min，1500rpm室温离心5min，去上清，加入2mLPBS洗涤细胞，1500rpm室温离心5min，弃上清，加入200μlPBS悬起细胞，流式细胞仪检测。图1是人外周血淋巴细胞中NK细胞比例的流式细胞术检测结果，可以看出，人外周血中NK细胞的比例比较低，仅为13.15％。3.流式细胞术检测扩增后NK细胞的表达取实施例1扩增培养后的NK细胞200μl，加入流式管中，加入不同荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)收集血浆：取外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；(2)制备外周血单个核细胞：用生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离并用生理盐水洗涤后，获得外周血单个核细胞；(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO2的条件下进行培养；(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养2‑4d后，用含有IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2‑3×10

【技术特征摘要】
1.一种大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)收集血浆：取外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；(2)制备外周血单个核细胞：用生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离并用生理盐水洗涤后，获得外周血单个核细胞；(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO2的条件下进行培养；(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养2-4d后，用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×106个细胞/mL，37℃、5％CO2的条件下培养10-16d，即得大量的NK细胞。2.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。3.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔久嵬，李赵志，牛超，李薇，高千惠，
申请(专利权)人：吉林大学第一医院，
类型：发明
国别省市：吉林,22