一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法技术

本发明专利技术涉及一种成脂诱导培养液及成脂分化方法。该成脂诱导培养液包括：3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松、三氟柳。本发明专利技术多种诱导因子联合应用作用于人脂肪干细胞，能有效的诱导脂肪干细胞成脂分化，缩短成脂时间，提高成脂的质量。其成脂分化效果显著优于现有常规的诱导方法。

A medium for adipogenic induction and differentiation and a method for adipogenic induction and differentiation

The invention relates to an adipogenic induction medium and a method for adipogenic differentiation. The adipogenic induction medium includes 3 isobutyl 1 methylxanthine, insulin, dexamethasone and trifluorosalicylic acid. The combined application of various inducing factors in human adipose stem cells can effectively induce adipogenic differentiation of adipose stem cells, shorten the time of adipogenic differentiation and improve the quality of adipogenic cells. The effect of lipid differentiation was significantly better than that of conventional induction methods.

【技术实现步骤摘要】
一种成脂诱导分化培养液及成脂诱导分化方法
本专利技术涉及一种成脂诱导分化培养液，还涉及一种成脂诱导分化方法。
技术介绍
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(totipotentstemcell，TSC)、多能干细胞(pluripotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)(专能干细胞)。干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。人脂肪干细胞(Humanadipose-derivedstemcells，HADSCs)，HADSC多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。HADSCs是从脂肪组织中提取出来的具有多能分化潜能的成体干细胞，拥有来源充足、取材方便、操作简单、提取率高、体外易培养、生物学性状稳定、免疫原性低、不受伦理学限制等优点，近年来受到广泛关注。现有的成脂诱导时间一般为14天以上，14天的成脂效果一般为较小的小液体，反应时间长、成脂效果一般。
技术实现思路
基于以上现有技术的不足，本专利技术提供一种成脂诱导分化培养液。使得成脂时间短，成脂质量高。一种成脂诱导分化培养液，所述培养液的原料组分包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和三氟柳。优选的，所述培养液的原料组分及其用量包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.25-1umol/l、胰岛素1-10mg/l、地塞米松0.5-1.5umol/l和三氟柳50-250umol/L。优选的，所述培养液的原料组分及其用量包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5umol/l、胰岛素10mg/l、地塞米松1umol/l和三氟柳200umol/L。本专利技术还提供一种成脂诱导分化方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液扩增脂肪干细胞；(2)将步骤(1)所述脂肪干细胞的第三代细胞接种到6孔板上，加入含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，待细胞长到100％开始加入如权利要求1-3任一项所述的成脂诱导分化培养液，每隔三天进行成脂诱导分化培养液更换。有益效果：本专利技术在缩短成脂时间的前提下提高脂肪干细胞的成脂效果。该技术能明显缩短成脂时间，提高成脂的质量。本专利技术在诱导9天时就能达到传统诱导成脂14天以上的效果，即节约了反应时间，又提高了成脂的效果。附图说明图1为CD44和CD105特异性标记物图谱。图2为CD34和CD45特异性标记物图谱。图3为实施例1细胞在诱导9天后，油红O染色显微镜下观察染色情况拍照图。图4为对比例1细胞在诱导9天后，油红O染色显微镜下观察染色情况拍照图。图5为对比例2细胞在诱导9天后，油红O染色显微镜下观察染色情况拍照图。图6为对比例3细胞在诱导9天后，油红O染色显微镜下观察染色情况拍照图。图7为对比例4细胞在诱导9天后，油红O染色显微镜下观察染色情况拍照图。具体实施方式本专利技术提供一种成脂诱导分化培养液，所述培养液的原料组分包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和三氟柳。作为本专利技术的一个实施例，所述培养液的原料组分及其用量具体包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.25-1umol/l、胰岛素1-10mg/l、地塞米松0.5-1.5umol/l和三氟柳50um-250um。实施例1一种成脂诱导分化方法，所述方法包括以下步骤：1.1脂肪干细胞提取与培养从滨州医学院附属医院产科剖腹产产妇皮下脂肪组织5g，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得产妇知情同意。用含有500U/ml双抗的PBS充分漂洗3遍，去掉血水；在PBS液体中剔除肉眼可见的血管及结缔组织，冲洗干净；用眼科剪将其充分剪碎；再用PBS反复冲洗，尽量去除红细胞；用吸管将脂肪碎块吸集到50ml离心管中；加入2倍体积0.2％的I型胶原酶；振荡混匀后，于37℃的恒温水浴锅中消化60min，期间每隔10min摇晃一次；加入等体积的含有体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM终止消化；1800rpm离心10min；离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等；用5ml吸管吸走上层和中层；加入1ml完全培养基重悬细胞；200目细胞过滤筛过滤，接种至100mm培养皿中；再吸取1ml完全培养基，洗涤离心管，重复上一步；于37℃，5％CO2饱和温度的条件下培养；24h后用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液半量换液；48h后全量换液；以后每3天换液一次每次10ml。获得第一代的脂肪干细胞。待细胞长满皿的80％-90％传代。1.2脂肪干细胞的上板及诱导当第一代的细胞长满皿的80％-90％传代，吸弃细胞上清液，用PBS润洗2次，每次3ml，加入室温放置30min的TE2ml，37℃CO2培养箱静止4min中，显微镜下观察到细胞变圆，在超净工作台中向细胞皿中加入3ml含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液用于终止消化。每皿一传二，获得第二代，当第二代细胞长满皿的80-90％同样的方法传代，获得的第三代细胞需要接种到6孔板上，用于做脂肪干细胞诱导成脂实验。通过血球计数使6孔板中每孔的细胞数保持在2×104个。每3天换一次液每次3ml，待细胞长到100％开始加入成脂诱导分化培养液。每3天换一次诱导液每次3ml，连续培养9天后用油红O染色，并在显微镜下观察染色状态并用拍照。所述成脂诱导分化培养液的的配置方法：3.9246mg地塞米松用10ml乙醇溶解，配成1mM的母液。20mg胰岛素用2ml10mM的HCL溶剂，配成10ug/ml母液。50mgIBMX用270ul1M的KOH与4.23ml的双蒸水混合液溶解，配成50mM母液。100mg三氟柳用8.06ml丙酮溶解0.22um配成50mM的母液(避光保存)。上述诱导成分0.22um滤头过滤-20℃备用。成脂诱导培养液中各组分的用量：胰岛素10mg/L、地塞米松1umol/L、IBMX0.5umol/L、三氟柳200umumol/L。1.3脂肪干细胞成脂染色配置油红O染液，称量0.15g的油红O粉末，用异丙醇定容至30ml，上下剧烈晃动使油红O溶解，漏斗过滤，待其过滤完后即获得油红O染液的母液，按照油红O母液：双蒸水等于9:6的比例配置油红O工作液。将六孔板的细胞诱导液吸弃，每孔PBS冲洗2次每次3ml，加入2ml4％的多聚甲醛固定细胞1h，吸弃上清，PBS冲洗2次每次3ml，加入2ml油红O工作液染色30min，吸弃上清，PBS冲洗2次每次3ml。75％的乙醇脱色，每孔1ml，20s。吸弃上清，3ml/次的PBS冲洗，直到吸弃的上清为无色，最后在每个六孔板中保留1mlPBS，显微镜下观察染色情况并拍照，如图3所示。1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成脂诱导分化培养液，其特征在于，所述培养液的原料组分包括：3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和三氟柳。

【技术特征摘要】
1.一种成脂诱导分化培养液，其特征在于，所述培养液的原料组分包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和三氟柳。2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液的原料组分及其用量包括：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.25-1umol/l、胰岛素1-10mg/l、地塞米松0.5-1.5umol/l和三氟柳50-250umol/L。3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液的原料组分及其用量包括：3-异丁基-1-甲基黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，徐晓艳，李玉秋，周鹏，
申请(专利权)人：山东华思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37