一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法。本发明专利技术通过两个特定的靶区域，设计特异性的引物和探针，实现对EBV‑DNA的准确检测；通过筛选特异性的抗体采用双抗体夹心的原理实现对EBNA‑1蛋白的准确检测。本发明专利技术将多重PCR检测EBV‑DNA及ELISA检测EBNA‑1蛋白联合使用，可以高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，克服了现有试剂盒不能检测处于潜伏感染状态下的EBV病毒促癌活性，有利于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定。

A Kit for Detecting EB Virus by Multiplex PCR, a Kit for Detecting and Evaluating EB Virus Activity and its Preparation Method

The invention relates to the field of in vitro diagnosis technology, in particular to a multiplex PCR kit for detecting EB virus, a kit for detecting and evaluating EB virus activity and a preparation method thereof. The invention realizes the accurate detection of EBV DNA by designing specific primers and probes through two specific target regions, and realizes the accurate detection of EBNA 1 protein by screening specific antibodies using the principle of double antibody sandwich. The method combines multiple PCR to detect EBV DNA and ELISA to detect EBNA 1 protein, which can efficiently and specifically detect the viral carcinogenic activity of EBV in human serum in the state of activation or latent infection, overcomes the inability of existing kits to detect the carcinogenic activity of EBV in latent infection, and is beneficial to the prediction of therapeutic effect and prognosis of EBV-related tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及体外诊断
，具体涉及一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)是一种嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病毒，它是第一个发现与人类肿瘤相关且普遍感染人类的疱疹病毒。随着分子生物学技术的进步及EBV相关性肿瘤发病机制及预后因素研究的深入，越来越多的研究发现，EBV相关性肿瘤患者EBV检测阳性率达90％以上，对EBV活性检测对于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定有重要意义。目前多数应用PCR检测EBV-DNA复制来评估EBV促癌活性，但是目前PCR检测大多是针对单一的目标区域，如EBNA-1区域或BamHI-W，由于EB病毒核酸拷贝数变异大，特别是BamHI-W序列不同人群拷贝数差异很大，单独使用不能准确定量，对于复制期的EBV感染较为敏感，但是对于潜伏感染的敏感性较差，而EBV相关肿瘤患者大多数的EBV处于潜伏感染。对于潜伏期的病毒感染或既往感染，往往采用病毒抗原检测的办法评估病毒感染情况，但大多数EBV抗原并不能有效反映病毒感染状态，却不能反应病毒活性。因此，如何选择合适的基因靶区域进行PCR检测，并选择合适的目标病毒抗原进行检测，实现联合检测，高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，成为了目前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，以BamH1-w保守序列和LMP1序列结合作为靶基因区域，对EB病毒特异性的DNA片段体现出良好的检测效果并且可以更准确检测EBV病毒阳性率。本专利技术的目的之二是提供一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，特定靶区域多重PCR定量，结合特定病毒抗原检测，可以高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，克服了现有试剂盒不能检测处于潜伏感染状态下的EBV病毒促癌活性，有利于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定。同时，本专利技术的目的之三是提供一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒的制备方法。一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对和内参探针；第一探针、第二探针和内参探针的5’端分别标记不同的荧光基团；其中第一引物对的序列为：上游引物：5’-GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5’-GGGGGCCTGTGGTGGTGAG-3’，如SEQIDNO.2所示；第一探针的序列为：5’-CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC-3’，如SEQIDNO.3所示；第二引物对的序列为：上游引物EBF-4：5’-CTAGCGACTCTGCTGGAAAT-3’，如SEQIDNO.4所示；下游引物EBR-5：5’-GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT-3’，如SEQIDNO.5所示；第二探针序列为：5’-GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG-3’，如SEQIDNO.6所示。可选的，所述内参引物对的序列为：上游引物：5’-CTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTG-3’，如SEQIDNO.7所示；下游引物：5’-CTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，如SEQIDNO.8所示；内参探针的序列为：5’-ACACTGTGCCCATCTACGA-3’，如SEQIDNO.9所示。其中第一引物对和第一探针为根据EB病毒基因保守序列BamH1-w(BWRF1)序列中的靶片段进行设计，该靶片段的序列如SEQIDNO.12所示；第二引物对和第二探针为根据EB病毒基因保守序列LMP1序列中的靶片段进行设计，该靶片段的序列如SEQIDNO.13所示；内参引物对和内参探针为根据β-actin基因进行设计，该靶片段的序列如SEQIDNO.14所示。可选的，所述第一探针5’端标记的荧光基团为FAM；第二探针5’端标记的荧光基团为Cy3；内参探针的5’端标记的荧光基团为HEX。可选的，所述第一探针、第二探针和内参探针的3’端标记荧光猝灭基团BHQ-3。可选的，还包括阴性质控品、阳性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶。其中阴性质控品为不含有EB病毒DNA片段的重组质粒；阳性质控品含有EB病毒DNA片段的重组质粒；阳性标准品为含有含有1×1010copy/mlEB病毒靶片段重组质粒，该靶靶片段序列如SEQIDNO.15所示。阳性标准品在使用过程中根据需要稀释为不同浓度，用于绘制标准曲线；PCR反应缓冲液为：pH8.0,0.1mol/L的Tris-HCl，含有20mmol/L的MgCl2。一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，包括上述多重PCR检测EB病毒的试剂盒和elisa试剂盒；其中elisa试剂盒包括第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物、显色剂、清洗液；第一抗体和第二抗体均为EBNA-1抗体，第一抗体和第二抗体的抗原表位不同。可选的，所述第一抗体为采用第一抗原多肽通过动物免疫筛选获得；第二抗体为采用第二抗原多肽通过动物免疫筛选获得；其中第一抗原多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，第二抗原多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。可选的，所述显色剂为TMB显色剂。上述检测评估EB病毒活性的试剂盒的制备方法，包括1)制备多重PCR检测EB病毒的试剂盒：A：依次根据序列设计合成所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对、内参探针；在第一探针、第二探针和内参探针标记所需的荧光基团；B：按要求制备阴性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶；C将步骤A和步骤B制备的各个引物对、各个探针和制备的各个组分按要求组装成多重PCR试剂盒；2)制备elisa试剂盒：a：按照第一抗原多肽和第二抗原多肽氨基酸序列合成第一抗原多肽和第二抗原多肽，然后利用合成的第一抗原多肽和第二抗原多肽依次分别进行动物免疫、细胞融合、腹水制备和配对抗体筛选获得第一抗体和第二抗体；b：采用第一抗体包被酶标板，采用生物素标记第二抗体；按要求制备链霉亲和素标记的辣根过氧化物和显色剂；c：将步骤a和步骤b制备的第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物和显色剂组装成所述的elisa试剂盒；3)将步骤1)制备的多重PCR试剂盒和步骤2)制备的elisa试剂盒组装成所述的试剂盒。一种采用上述试剂盒检测评估EB病毒活性的应用，其特征在于，其使用方法包括以下操作步骤：Ⅰ：将检测血液样本血清分离，作为血清样本；提取血清DNA，作为DNA样本；Ⅱ：多重PCR检测步骤Ⅰ制备的DNA样本：①：绘制标准曲线：配置PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液、0.8mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，5UDNA聚合酶，0.4μmol/L的第一引物对、第二引物对和内参引物对，0.4μmol/L的第一探针、第二探针和内参探针；秒，进行45个循环，检测时选择FAM通道本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对和内参探针；第一探针、第二探针和内参探针的5’端分别标记不同的荧光基团；其中第一引物对的序列为：上游引物：5’‑GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG‑3’，如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5’‑GGGGGCCTGTGGTGGTGAG‑3’，如SEQ ID NO.2所示；第一探针的序列为：5’‑CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC‑3’，如SEQ ID NO.3所示；第二引物对的序列为：上游引物EBF‑4：5’‑CTAGCGACTCTGCTGGAAAT‑3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物EBR‑5：5’‑GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT‑3’，如SEQ ID NO.5所示；第二探针序列为：5’‑GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG‑3’，如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对和内参探针；第一探针、第二探针和内参探针的5’端分别标记不同的荧光基团；其中第一引物对的序列为：上游引物：5’-GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5’-GGGGGCCTGTGGTGGTGAG-3’，如SEQIDNO.2所示；第一探针的序列为：5’-CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC-3’，如SEQIDNO.3所示；第二引物对的序列为：上游引物EBF-4：5’-CTAGCGACTCTGCTGGAAAT-3’，如SEQIDNO.4所示；下游引物EBR-5：5’-GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT-3’，如SEQIDNO.5所示；第二探针序列为：5’-GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG-3’，如SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参引物对的序列为：上游引物：5’-CTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTG-3’，如SEQIDNO.7所示；下游引物：5’-CTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，如SEQIDNO.8所示；内参探针的序列为：5’-ACACTGTGCCCATCTACGA-3’，如SEQIDNO.9所示。3.如权利要求1或2所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述第一探针5’端标记的荧光基团为FAM；第二探针5’端标记的荧光基团为Cy3；内参探针的5’端标记的荧光基团为HEX。4.如权利要求1或2所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述第一探针、第二探针和内参探针的3’端标记荧光猝灭基团BHQ-3。5.如权利要求3所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，张旭东，孙向东，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41