一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法技术

本发明专利技术建立了一种基于Tim‑3/Galectin‑9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法：将红色荧光蛋白tagRFP偶联于Galectin‑9蛋白羧基末端(C端)，构建真核表达载体，并制备Galectin‑9‑tagRFP融合蛋白；将Ceacam‑1构建在真核表达载体的CMV启动子下游，黄色荧光蛋白基因Ypet构建在Tim‑3蛋白的下游，以及青色荧光蛋白基因CyPet通过一个连接肽(G4S)3构建在Bat3基因的下游，分别构建真核表达载体，并获得新型的稳转细胞系Ceacam‑1.Tim‑3Ypet.Bat3CyPet/Jurkat，以Galectin‑9‑tagRFP与细胞系的亲和进行荧光检测筛选阻断剂。本方法可精确反映抗Tim‑3和抗Galectin‑9药的效应，可同时获得阻断功能与Tim‑3/Galectin‑9信号通路的生物学效应数据，构建快速筛选抗Tim‑3和抗Galectin‑9药物和评估其生物学效应的实验模型。

A Rapid Screening Method for Drugs Based on Tim-3/Galectin-9 Blocking Function and Its Biological Effects

The invention establishes a rapid drug screening method based on Tim_3/Galectin_9 blocking function and its biological effect: the red fluorescent protein tagRFP is coupled to the carboxyl end (C end) of Galectin_9 protein, the eukaryotic expression vector is constructed, and the Galectin_9_tagRFP fusion protein is prepared; Ceacam_1 is constructed downstream of the CMV promoter of the eukaryotic expression vector, and the yellow fluorescent protein gene Ypet is constructed. Eukaryotic expression vectors were constructed downstream of Tim_3 protein and cyan fluorescent protein gene CyPet was constructed downstream of Bat3 gene through a ligand peptide (G4S) 3. A new stable cell line Ceacam_1.Tim_3Ypet.Bat3CyPet/Jurkat was obtained. The blockers were screened by fluorescence detection of affinity between Galectin_9_tag RFP and cell line. This method can accurately reflect the effects of anti-Tim_3 and anti-Galectin_9 drugs, simultaneously obtain the biological effect data of blocking function and Tim_3/Galectin_9 signaling pathway, and construct an experimental model for rapid screening anti-Tim_3 and anti-Galectin_9 drugs and evaluating their biological effects.

【技术实现步骤摘要】
一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法
本专利技术涉及一种基于Tim-3/Galectin-9靶点及其生物效应的药物快速筛选方法，属于生物

技术介绍
膜型Tim-3分子是一种单跨膜分子，c端位于胞内，胞内域富含酪氨酸；N端位于胞外，胞外域包括IgV亚单位、黏蛋白样结构域，它们共同参与配体的识别。Ceacam-1又称为CD66a(分化簇66a)，人糖蛋白，是癌胚抗原(CEA)基因家族一员。有研究表明T细胞中TIM-3的表达与Ceacam-1的表达具有非常强的相关性。半乳糖凝集素-9(Galectin-9，Gal-9)是Tim-3的配体，也是一种膜蛋白分子，在肿瘤细胞表面往有高表达。Galectin-9与T细胞表面的Tim-3结合，触发胞内的信号通路。Tim-3在非激活状态时，胞内段与Bat3结合而被抑制；当Tim-3胞外域与Galectin-9结合时，Bat3从Tim-3胞内段解离而使Tim-3向胞内转导抑制信号。最终可导致T细胞功能的抑制，如促进性细胞因子产生的减少，T细胞增殖力降低，促进T细胞衰竭和凋亡。Tim-3/Galectin-9信号通路在T细胞活性和数量的调节上起着重要作用。因此，Tim-3和Galectin-9分子与机体的抗肿瘤免疫、抗病毒免疫和自身免疫性疾病关系密切，已成为抗肿瘤药物研究的热门靶点之一。基于Tim-3/Galectin-9阻断功能的抗癌新药，包括抗Tim-3、抗Galectin-9单抗药、小分子阻断剂、多肽阻断剂等的研发是目前医药领域热点之一。但目前为止尚未见有关基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物学效应的新药快速、高效而精准的筛选系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立了一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法。本专利技术构思如下：采用红色荧光蛋白tagRFP偶联于Galectin-9蛋白羧基末端，将该荧光蛋白标记基因构建载体并在细胞内表达，制备融合蛋白。将黄色荧光蛋白基因Ypet构建在Tim-3蛋白的下游，并克隆到真核表达载体CMV启动子下；将青色荧光蛋白基因CyPet通过一个连接肽(G4S)3构建在Bat3基因的下游，并克隆到真核表达载体CMV启动子下；将三个基因质粒共转染到细胞，建立稳转细胞系。将抗Tim-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与稳转细胞一起共孵育后再与Galectin-9-tagRFP融合蛋白共孵育；或将抗Galectin-9的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与Galectin-9-tagRFP融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育；清洗非特异性结合后检测荧光值。通过检测红色荧光蛋白tagRFP荧光值判断该抗Tim-3药和抗Galectin-9药是否具有Tim-3/Galectin-9阻断功能；通过检测CyPet/Ypet的FRET荧光值并与对照组比较，判断抗Tim-3药和抗Galectin-9药是否具有Tim-3.Bat3信号通路的生物学效应。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与Galectin-9蛋白羧基末端构建重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白；2)将第二荧光蛋白连与Tim-3蛋白羧基末端，并克隆在真核表达载体的CMV启动子下，构建表达质粒；将Ceacam-1克隆到CMV启动子下，构建表达质粒；3)将第三荧光蛋白与Bat3蛋白羧基末端，并克隆在真核表达载体的CMV启动子下，构建表达质粒。4)将CMV-Ceacam-1、Tim-3-第二荧光蛋白和Bat3-第三荧光蛋白质粒共转染到人源T淋巴细胞中，建立稳转细胞系；5)抗Tim-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与稳转细胞孵育后再与重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育，清洗非特异性结合；6)抗Galectin-9的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后，与稳转细胞孵育，清洗非特异性结合；7)分别检测第一荧光蛋白荧光值、和第二荧光蛋白/第三荧光蛋白的FRET荧光值，并判断新药对Tim-3/Galectin-9的阻断功能及对Tim-3.Bat3信号通路产生的生物学效应。进一步地，第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet；第三荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet。进一步地，步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长Galectin-9基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP融合在Galectin-9蛋白C端形成所述Galectin-9-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签，获得表达质粒pCMV-Gal-9tagRFP。进一步地，步骤1)中，将Galectin-9-tagRFP基因克隆至真核高表达载体CMV启动子下游，获得质粒pCMV-Galectin-9-tagRFP，并转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达Galectin-9-tagRFP融合蛋白的Galectin-9-tagRFP/293细胞系；扩增该Galectin-9-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白。进一步地，步骤2)中，将黄色荧光蛋白Ypet基因与人全长Tim-3基因构建在同一个读码框使黄色荧光蛋白Ypet融合在Tim-3蛋白C端，并克隆在真核表达载体的CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-Tim-3Ypet；将Ceacam-1克隆到CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-Ceacam-1。进一步地，步骤3)中，将青色荧光蛋白CyPet基因与Bat3基因构建在同一个读码框使青色荧光蛋白CyPet连于Bat3蛋白C端，并克隆在真核表达载体的CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-Bat3CyPet。进一步地，步骤4)中，将pCMV-Ceacam-1、pCMV-Tim-3Ypet和pCMV-Bat3CyPet质粒分别与慢病毒包装质粒pH1、pH2共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备CMV-Tim-3Ypet、CMV-Bat3(G4S)3CyPet、CMV-Ceacam-1慢病毒，并共转染到人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat中，建立稳转细胞系Ceacam-1.Tim-3Ypet.Bat3CyPet/Jurkat。进一步地，步骤5)中，抗Tim-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与稳转细胞Ceacam-1.Tim-3Ypet.Bat3CyPet/Jurkat孵育后再与重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白共孵育；同时设立重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白与稳转细胞直接共孵育的对照组。进一步地，步骤6)中，抗Galectin-9的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白共孵育后，与稳转细胞Ceacam-1.Tim-3Ypet.Bat3CyPet/Jurkat共孵育；同时设立重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白与稳转细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Tim‑3/Galectin‑9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与Galectin‑9蛋白羧基末端连接构建重组Galectin‑9‑第一荧光蛋白融合蛋白；在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；2)将第二荧光蛋白连接在Tim‑3蛋白的羧基末端，并克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；将第三荧光蛋白通过一个连接肽(G4S)3连在Bat3蛋白的羧基末端，并克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；将Ceacam‑1克隆到CMV启动子下，构建表达质粒；将CMV‑Ceacam‑1基因、Tim‑3‑第二荧光蛋白基因和CMV‑Bat3(G4S)3‑第三荧光蛋白基因共转染到Jurkat细胞，并建立新型的稳转细胞系；3)将抗Tim‑3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与稳转细胞共孵育后加入重组Galectin‑9‑第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；同时设立稳转细胞与重组Galectin‑9‑第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；4)将抗Galectin‑9的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与Galectin‑9‑第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育；同时设立与Galectin‑9‑第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；5)分别检测第一荧光蛋白荧光值、第二荧光蛋白/第三荧光蛋白FRET荧光值，并判断新药对Tim‑3/Galectin‑9信号通路的阻断功能。...

【技术特征摘要】
1.一种基于Tim-3/Galectin-9阻断功能及其生物效应的药物快速筛选方法，包括以下步骤：1)将第一荧光蛋白与Galectin-9蛋白羧基末端连接构建重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白；在第一荧光蛋白的C端连接6个组氨酸His标签；2)将第二荧光蛋白连接在Tim-3蛋白的羧基末端，并克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；将第三荧光蛋白通过一个连接肽(G4S)3连在Bat3蛋白的羧基末端，并克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒；将Ceacam-1克隆到CMV启动子下，构建表达质粒；将CMV-Ceacam-1基因、Tim-3-第二荧光蛋白基因和CMV-Bat3(G4S)3-第三荧光蛋白基因共转染到Jurkat细胞，并建立新型的稳转细胞系；3)将抗Tim-3的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与稳转细胞共孵育后加入重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育；同时设立稳转细胞与重组Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；4)将抗Galectin-9的单抗药、小分子、或多肽阻断剂等新药与Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白共孵育后再与稳转细胞一起共孵育；同时设立与Galectin-9-第一荧光蛋白融合蛋白直接共孵育的对照组；清洗非特异性结合；5)分别检测第一荧光蛋白荧光值、第二荧光蛋白/第三荧光蛋白FRET荧光值，并判断新药对Tim-3/Galectin-9信号通路的阻断功能。2.根据权利要求1的药物快速筛选方法，其中第一荧光蛋白是tagRFP红色荧光蛋白；第二荧光蛋白是黄色荧光蛋白Ypet；第三荧光蛋白是青色荧光蛋白CyPet。3.根据权利要求2的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将红色荧光蛋白tagRFP基因与人全长Galectin-9基因构建在同一个读码框使红色荧光蛋白tagRFP融合在Galectin-9蛋白C端形成所述的Galectin-9-tagRFP融合蛋白，同时在tagRFP的C端接上6个组氨酸His标签。4.根据权利要求3的药物快速筛选方法，其中步骤1)中，将Galectin-9-tagRFP基因克隆至真核高表达载体CMV启动子下游，并转染至人胚肾细胞293，筛选克隆获得高表达Galectin-9-tagRFP融合蛋白的Galectin-9-tagRFP/293细胞系；扩增该Galectin-9-tagRFP/293细胞，裂解后用His亲和法制备纯化重组Galectin-9-tagRFP融合蛋白。5.根据权利要求4的药物快速筛选方法，其中步骤2)中，将黄色荧光蛋白Ypet基因与人全长Tim-3基因构建在同一个读码框使黄色荧光蛋白Ypet融合在Tim-3蛋白C端形成所述的Tim-3-Ypet融合蛋白，并克隆到真核表达载体CMV启动子下，构建表达质粒pCMV-Tim-3Ypet。6.根据权利要求5的药物快速筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，吴王亲，武虎，匡红，刘美星，莫一平，
申请(专利权)人：杭州科兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33