玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用技术

本发明专利技术属于玉米抗性基因技术领域，具体涉及一种玉米Zm‑APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用。提供了一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记及其获得方法，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.10所示的Zm‑APX基因。本发明专利技术还提供了一种利用所述分子标记构建转基因玉米植株，并用于防治玉米茎腐病的方法。本发明专利技术通过检测Zm‑APX转基因材料并鉴定其茎腐病抗病性，发现Zm‑APX基因可提高玉米对茎腐病的抗性，为玉米茎腐病的抗病性育种提供了基因资源。

Molecular Marker of Zm-APX Gene in Maize and Its Application in Stem Rot Control

The invention belongs to the technical field of maize resistance gene, in particular to a molecular marker of maize Zm APX gene, a method for obtaining the molecular marker, and an application in the prevention and control of stem rot. A molecular marker capable of identifying maize stem rot disease and a method for obtaining the molecular marker are provided. The molecular marker is Zm_APX gene as shown in SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.10. The invention also provides a method for constructing transgenic maize plants by using the molecular markers and for preventing maize stem rot. The invention detects the Zm APX transgenic material and identifies its resistance to stem rot, finds that the Zm APX gene can improve the resistance of Maize to stem rot, and provides genetic resources for breeding resistance to corn stem rot.

【技术实现步骤摘要】
玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用
本专利技术属于玉米抗性基因
，具体涉及一种玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用。
技术介绍
玉米是世界上最为广泛栽培的粮食作物之一。一方面，玉米为人类和动物提供了大量的食物来源，但另一方面，玉米病害的发生可导致巨大的经济损失。尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性，同时，造成的药物残留对人类的生命安全也有潜在的威胁。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。玉米茎腐病又称玉米茎基腐病、青枯病，该病害由多种病原菌单独或复合侵染引起，玉米茎腐病是典型的土传病害，致病菌在土壤、肥料、病残体或玉米种子上越冬，病残体及带病玉米种子是主要的初侵染源，病原菌借助风、水、机械及昆虫等进行传播，侵入根部及根茎部伤口，引起植株发病。由于近些年玉米自交系与杂交种在区域间引种频繁，导致茎腐病在玉米种植区大面积传播。相关报道指出，每年茎腐病在玉米主产区的发病率在10％-20％，一些年份更是达到60％，造成产量损失达25％。特定基因是鉴定植物抗性的有效手段，但是目前尚未发现可以有效鉴定玉米茎腐病的抗性基因，限制了玉米品种的改良。因此，挖掘新的玉米茎腐病抗性基因，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种玉米Zm-APX基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用，提供了一种有效鉴定玉米茎腐病的抗性基因。本专利技术的第一个目的是提供一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，所述分子标记为如SEQIDNO.1或者SEQIDNO.10所示的Zm-APX基因。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，包括以下步骤：步骤1，提取玉米总RNA，备用；步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；步骤3，分子标记的克隆合成引物：Zm-APXF2:5'-TCCTTGCAACCCTCCGCCCTTTC-3'；Zm-APXR2:5'-TTGCCGAACCAACGGAAACTAG-3'；用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer4μl、10mMdNTP1μl、Zm-APXF20.5μl、Zm-APXR20.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H2O17μl；PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1186bp的条带，即获得能够鉴定玉米茎腐病的分子标记。优选的，将回收1186bp的条带转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。本专利技术的第三个目的是提供一种所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用。优选的，利用所述分子标记Zm-APX基因构建能够稳定表达Zm-APX的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米茎腐病抗性的阳性转基因株系。优选的，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的Zm-APX的过表达载体按照以下步骤构建：合成引物：Zm-APXR5：5'-ACCCATGGATGGCGAAGAACTAC-3'；Zm-APXF5：5'-ACAGATCTTTAAGCATCAGCAAA-3'；以含有Zm-APX基因的大肠杆菌感受态细胞为模板进行PCR扩增，PCR结束后，琼脂糖凝胶检测，回收目的DNA条带，并将回收的目的DNA条带与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒PMD-Zm-APX；将重组质粒PMD-Zm-APX和质粒载体pCAMBIA3301分别用NcoI和BglⅡ双酶切，分别回收PMD-Zm-APX目的片段和线性的质粒载体pCAMBIA3301目的片段；两个双酶切产物经T4T4-DNA连接，构建成Zm-APX过表达载体，命名为pCAMBIA3301-Zm-APX保存备用；用pCAMBIA3301-Zm-APX转化农杆菌感受态细胞，得到转化菌；将转化菌导入到玉米幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生，获得T0代转基因材料。优选的，种植T0代转基因材料，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的阳性植株，阳性植株自交获得T0代种子；种植获得的T0代转基因玉米株系，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T0代阳性植株，T0代阳性植株自交得到T1代种子；筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T1代阳性植株，T1代阳性植株自交得到T2代种子，种植T2代种子，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T2代阳性植株，T2代阳性植株为稳定性高的抗玉米茎腐病植株。优选的，PCR的反应体系如下：模板1μl、PremixTaq12.5μl、Zm-APXF51μl、Zm-APXR51μl、ddH2O9.5μl；PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。与现有技术相比，本专利技术提供的一种Zm-APX基因在玉米茎腐病防治中的应用至少具有以下有益效果：本专利技术通过检测Zm-APX转基因材料并鉴定其茎腐病抗病性，结果显示在转基因阳性株系中Zm-APX的表达量显著高于阴性株系。人工接种致茎腐病菌株后，在Zm-APX转基因阳性株系中病斑的扩展速度显著小于阴性株系。对病斑大小的统计数据进行差异性分析，结果表明，Zm-APX转基因阳性株系中病斑的大小在接种后的各时期均显著小于阴性株系。结合转基因阳性株系和阴性株系的qRT-PCR结果我们可以发现Zm-APX基因可提高玉米对茎腐病的抗性，实验结果为进一步探究Zm-APX的功能奠定了一定的基础，同时也为玉米茎腐病的抗病性育种提供了基因资源。利用本专利技术提供的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记Zm-APX基因可有效鉴定玉米品种是否抗病，也可构建转基因植株，以增加原玉米品种的茎腐病抗性，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。附图说明图1是本专利技术玉米总RNA和玉米18ScDNA第一链的电泳图；图1A是玉米总RNA，1、2泳道均是玉米总RNA；图1B是玉米18ScDNA第一链，M泳道为DL2000，1-4泳道均是玉米18ScDNA第一链；图2是Zm-APXF2、Zm-APXR2引物扩增和5个阳性克隆子的检测结果；图2A是Zm-APXF2、Zm-APXR2引物扩增结果，其中M号泳道是DL2000，1号泳道是扩增产物；图2B是5个阳性克隆子的检测结果，其中M号泳道是DL2000，1-5号泳道是阳性克隆子；图3是Zm-APXR5、Zm-APXF5引物PCR产物电泳结果；其中M号泳道是BM5000，1-2号泳道是PCR产物；图4是PMD-Zm-APX和质粒载体pCAMBIA3301的双酶切电泳结果；图4A是PMD-Zm-APX双酶切电泳结果,M号泳道是DL2000，1-2号泳道是PMD-Zm-APX双酶切产物；图4B是质粒载体pCAMBIA3301的双酶切电泳结果，M号泳道是DL150000，1-3号泳道是pCAMBIA3301的双酶切产物；图5是T2代转基因玉米植株PCR检测结果；M号泳道是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.10所示的Zm‑APX基因。

【技术特征摘要】
1.一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQIDNO.1或者SEQIDNO.10所示的Zm-APX基因。2.一种权利要求1所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取玉米总RNA，备用；步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；步骤3，分子标记的克隆合成引物：Zm-APXF2:5'-TCCTTGCAACCCTCCGCCCTTTC-3'；Zm-APXR2:5'-TTGCCGAACCAACGGAAACTAG-3'；用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer4μl、10mMdNTP1μl、Zm-APXF20.5μl、Zm-APXR20.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H2O17μl；PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1186bp的条带，即获得能够鉴定玉米茎腐病的分子标记。3.根据权利要求2所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，将回收1186bp的条带转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。4.根据权利要求1所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用。5.根据权利要求4所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用，其特征在于，利用所述分子标记Zm-APX基因构建能够稳定表达Zm-APX的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米茎腐病抗性的阳性转基因株系。6.根据权利要求5所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.10所示的Zm-APX的过表达载体按照以下步骤构建：合成引物：Zm-APXR5：5'-ACCCATGGATGGCGAAGAACTAC-3'；Zm-APXF5：5'-ACAGAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刘记，王顺喜，陈赞，张雪海，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41