一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，大致步骤如下：1)重组质粒构建；2)慢病毒样颗粒的制备；3)hTERT基因的细胞系构建和筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测；5)hETRT蛋白表达检测。本发明专利技术构建方法有利于改善目前细胞系匮乏的研究现状，有利于资源的推广使用。绵羊羊睾丸永生化细胞系的建立减少了实验动物的使用量，提供了一种更为稳定的实验研究对象。

Construction of immortalized sheep testicular cell line and its application

The invention discloses 1. A method for constructing immortalized sheep testicular cell line, which includes the following steps: 1) construction of recombinant plasmid; 2) preparation of lentivirus-like particles; 3) cell line construction and screening of hTERT gene; 4) detection of hTERT gene expression and its transcription level; 5) detection of hETRT protein expression. The construction method of the present invention is advantageous to improving the present research situation of the lack of cell lines and promoting the use of resources. Establishment of immortalized sheep testicular cell lines reduced the use of experimental animals and provided a more stable experimental research object.

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法及其应用。
技术介绍
细胞永生化(immortalization)是指细胞自发或受外界因素影响逃离增殖危机，从而获得无限增殖的能力。自发性的细胞永生化概率很小，对于啮齿类动物为10-5～10-6，人类细胞概率更低，小于10-12。正常动物细胞在体外增殖培养是有限的，该自然极限称为海弗里克极限(Hayflicklimit)，细胞生长代谢的过程需要复杂的调节网络，一旦该网络发生错误，细胞会跨越自然极限，形成永生化。细胞的分裂增殖过程会要经过衰老期M1期和致死期M2期，跨越这两期的细胞可实现永生化。真核细胞内存在多种抑癌基因如p53、pRb、DPC4、BRCA1等，抑癌基因表达下调与端粒酶的相互作用可能对细胞癌变及永生化产生影响。有学者从人乳腺癌细胞核中分离得到p53蛋白，进一步的试验证明p53蛋白可以体外抑制端粒酶的活性。同时期，人们发现p53基因突变可以导致端粒酶激活，从而促使细胞的永生化。通过不同放射性元素如X射线、核辐射、电离辐射等刺激细胞也可实现细胞永生化，有研究中发现核弹辐射后的人皮细胞具有无限增殖的能力。通过基因转染等技术，可将病毒的基因、原癌基因、端粒酶等导入目的细胞内，或者可以延长细胞传代次数或者实现完全细胞永生化。端粒是位于真核细胞染色体两端末端，由长度为5～15bp的重复DNA序列和周围蛋白质组成的帽状结构。端粒可以保证染色体的完整性，同时调节细胞生命周期，端粒的功能障碍会直接导致细胞增殖停止和凋亡。端粒酶由RNA和蛋白质组成，是一种逆转录酶。端粒酶利用自身的RNA为模板，可以延伸端粒3’末端或者合成新的端粒DNA。因此端粒酶可以维持端粒结构和长度稳定，还可以提高细胞对应急预案和毒力因子的耐受力，在细胞永生化过程发挥重要作用。人端粒酶逆转录酶亚基(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)首次在人类宫颈癌细胞中发现，同时还发现了端粒酶RNA(telomeraseRNA，TR)和端粒酶相关蛋白(telomerase-associatedprotein，TEP)。目前的研究表明，端粒(telomere)及端粒酶(telomerase)与细胞永生化有关。约80％的肿瘤细胞和永生化细胞系端粒酶活性检测均为阳性，其余肿瘤细胞和永生化细胞系可检测出足够的端粒长度。因此，恶性肿瘤的治疗方案中使用降低端粒酶的方法曾一度受到广泛关注。但是，恶性肿瘤前期细胞端粒很短，而且端粒短的人更能抵抗黑色素瘤。这与前期的研究结果是相互矛盾的。Hockemeyer等发现，永生化分两个过程，首先是端粒酶的突变引起的，端粒酶基因上游的启动子(TERT)发生突变，但是该突变水平很低，还不足以使癌细胞永生化，但可以延缓细胞衰老，且端粒酶水平会逐渐上调；第二步，含有短端粒的染色体可能发生功能异常，促使基因组的改变，从而细胞实现永生化。这也解释了，端粒较短，但端粒酶水平高的细胞更容易演变成癌细胞的原因。因此，运用质粒转导及病毒感染等方法，将端粒酶基因导入细胞，端粒酶的表达及激活是实现细胞永生化的重要步骤。由于目前还没有建立绵羊睾丸永生化细胞系的先例，因此本研究以建立永生化羊睾丸细胞系为目的，通过向体外羊睾丸细胞导入外源性基因，成功建立了绵羊羊睾丸细胞永生化的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的正是为了解决上述问题，而提出一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，有利于改善目前细胞系匮乏的研究现状，有利于资源的推广使用。绵羊羊睾丸永生化细胞系的建立减少了实验动物的使用量，提供了一种更为稳定的实验研究对象。本专利技术提供了一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，具体步骤如下：1)重组质粒构建：根据人的端粒酶的全基因序列设计一对扩增hTERT基因PCR特异性引物，将扩增的hTERT基因重组转载到重组质粒pLOV-CMV上，获得重组质粒pLOV-CMV-hTERT；2)慢病毒样颗粒的制备：对步骤1)重组质粒pLOV-CMV-hTERT用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT，将无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT、包装质粒pSPAX2以及外膜质粒pMD2.G质粒用转染试剂共转染到293T细胞中，转染30h收集细胞上清液，并置于-80℃保存；3)表达hTERT基因的细胞系构建和筛选：用步骤2)中慢病毒样颗粒的细胞培养上清液感染绵羊睾丸细胞，用嘌呤霉素培养基进行筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测：提取步骤3)筛选后细胞系的总DNA和总RNA，用PCR检测hTERT基因表达，用RT-PCR方法检测hTERT基因的mRNA转录水平；5)hETRT蛋白表达检测：取步骤3)细胞系的细胞进行Westernblotting检测和间接免疫荧光检测，以鉴定hTERT蛋白的表达。作为优选手段，所述hTERT基因PCR特异性引物的序列如下：hTERT-NheⅠ-F：5’-CTAGCTAGCTAGATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’，hTERT-NotⅠ-R：5’-TTGCGGCCGCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3’。作为进一步地优选手段，所述步骤3)中嘌呤霉素培养基的嘌呤霉素浓度为0.75μg/mL。作为进一步地优选手段，所述步骤5)中Westernblot检测中，一抗为Flag标签单抗，β-actin为内参蛋白，二抗为辣根酶标记的抗鼠二抗；间接免疫荧光检测中，一抗为hTERT多克隆抗体，二抗为AlexaFluor594GoatAnti-rabbitIgG。作为进一步地优选手段，所述hTERT基因的基因序列如SEQIDNo.1所示。作为进一步地优选手段，所述hTERT基因的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。一种采用上述绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系构建方法构建的细胞系在病毒感染实验中的应用。本专利技术有益效果：1、Ov-st(绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系)的建立成功，也为其他细胞系的建立，提供了很好的借鉴，有利于改善目前细胞系匮乏的研究现状，有利于资源的推广使用。绵羊羊睾丸永生化细胞系的建立减少了实验动物的使用量，提供了一种更为稳定的实验研究对象。2、由于hTERT基因的片段相对较长，不易扩增以及基因片段不易转入质粒中，本专利技术设计的引物，其扩增效果好，且慢病毒系统能够携带较大的片段的外源基因，对细胞毒性小，由慢病毒介导并整合到靶细胞基因组中的靶基因不仅对转录沉默有较强的抗性，比使用脂质体瞬转穿梭质粒的方法更易于获得稳定表达目的基因的细胞系。3、绵羊羊睾丸细胞的分化度低，易于细胞培养，再分化，通过慢病毒样颗粒感染绵羊睾丸细胞，易于生成永生化细胞，且生成的永生化细胞稳定。附图说明图1为本专利技术的pLOV-CMV-hTERT的构建与鉴定结果图(M：DNA分子质量标准；1：hTERT基因的PCR扩增；2：阴性对照；3：pLOV-CMV-hTERT经NheⅠ和NotⅠ酶双酶切产物)。图2为本专利技术的Ov-ST细胞的hTERT基因检测结果图(M：DNA分子质量标准；1：第10代Ov-ST细胞的hTERT基因；2：第20代Ov-ST细胞的h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：1)重组质粒构建：根据人的端粒酶的全基因序列设计一对扩增hTERT基因PCR特异性引物，将扩增的hTERT基因重组转载到重组质粒pLOV‑CMV上，获得重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT；2)慢病毒样颗粒的制备：对步骤1)重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT，将无内毒素的重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT、包装质粒pSPAX2以及外膜质粒pMD2.G质粒用转染试剂共转染到293T细胞中，转染30h收集细胞上清液，并置于‑80℃保存；3)表达hTERT基因的细胞系构建和筛选：用步骤2)中慢病毒样颗粒的细胞培养上清液感染绵羊睾丸细胞，用嘌呤霉素培养基进行筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测：提取步骤3)筛选后细胞系的总DNA和总RNA，用PCR检测hTERT基因表达，用RT‑PCR方法检测hTERT基因的mRNA转录水平；5)hETRT蛋白表达检测：取步骤3)细胞系的细胞进行Western blotting检测和间接免疫荧光检测，以鉴定hTERT蛋白的表达。...

【技术特征摘要】
1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：1)重组质粒构建：根据人的端粒酶的全基因序列设计一对扩增hTERT基因PCR特异性引物，将扩增的hTERT基因重组转载到重组质粒pLOV-CMV上，获得重组质粒pLOV-CMV-hTERT；2)慢病毒样颗粒的制备：对步骤1)重组质粒pLOV-CMV-hTERT用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT，将无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT、包装质粒pSPAX2以及外膜质粒pMD2.G质粒用转染试剂共转染到293T细胞中，转染30h收集细胞上清液，并置于-80℃保存；3)表达hTERT基因的细胞系构建和筛选：用步骤2)中慢病毒样颗粒的细胞培养上清液感染绵羊睾丸细胞，用嘌呤霉素培养基进行筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测：提取步骤3)筛选后细胞系的总DNA和总RNA，用PCR检测hTERT基因表达，用RT-PCR方法检测hTERT基因的mRNA转录水平；5)hETRT蛋白表达检测：取步骤3)细胞系的细胞进行Westernblotting检测和间接免疫荧光检测，以鉴定hTERT蛋白的表达。2.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王桂军，刘光清，周晓雅，周祺，邢雪，许泽军，顾香雪，黄荣，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34