一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽制造技术

本发明专利技术公开一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，具体涉及一种多肽在治疗白血病药物中的应用，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：Lys‑Glu‑Ser‑Met‑Asp‑Ala‑Asn‑Lys‑Pro‑Thr‑Lys‑Asn‑Leu‑Pro‑Leu‑Lys‑Lys‑Ile‑Pro‑Cys‑Lys‑Thr‑Ser‑Ala‑Pro‑Ser‑Gln‑Ser‑Phe‑Phe‑Ala‑Arg‑Asp‑Asn‑Thr‑Ala‑Asn，所述多肽的N端与肉豆蔻酸连接，本发明专利技术制备的多肽，通过与肉豆蔻酸连接，可以进入白血病细胞，达到抑制白血病细胞的增殖的效果。

A polypeptide with inhibitory effect on proliferation of leukemia cells

The invention discloses a polypeptide having the function of inhibiting leukemia cell proliferation, specifically relating to the application of a polypeptide in the treatment of leukemia drugs. The polypeptide consists of 37 amino acids, the amino acid sequence is Lys Glu Ser Met Asp Ala Asn Lys Pro Thr Lys Asn Leu Pro Pro Leu Pro CyCyCyCyCyLeys Leys Lys Iles Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro ILys Thr Ser Ala Pro Ser Gln_Ser_Phe_Phe_Ala_Arg_Asp_Asn_Thr_Ala_Asn. The N-terminal of the polypeptide is connected with myristic acid. The polypeptide prepared by the invention can enter leukemia cells by connecting with myristic acid and achieve the effect of inhibiting the proliferation of leukemia cells.

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽
本专利技术属于生物化学中的多肽药物
，具体涉及一种多肽在治疗白血病药物中的应用。
技术介绍
白血病是一种造血干细胞恶性肿瘤。临床上按照其发病的缓急和病变细胞将其分类，由于白血病发病分型和预后分层较为复杂，因此需制定综合性的治疗方案，近年来随着医疗技术的发展，相当多的患者可以得到治愈，但是仍有一部分人不能得到治疗或者是由于对治疗药物产生耐药性、治疗的副作用和预后而受病痛，化疗药物除能治愈个别类型的白血病，其他类型白血病的治疗仍面临诸多困扰。如急性髓细胞白血病细胞系(AML)和急性T淋巴细胞白血病细胞系(T-All)，目前无相应的靶向药物，化疗效果也非常不理想，因此寻找新的治疗手段刻不容缓。Schneider用血清饥饿的方法处理NIH-3T3(小鼠成纤维细胞)鉴定出一组特异性高表达的基因，并称之为Growth-arrestSpecificGenes(生长特异抑制性基因)，GAS2是其中的一员。有文献报道，GAS2在多种恶性血液肿瘤和结肠癌中表现为异常性高表达，并且在结肠癌细胞和BCR-ABL+造血细胞中打靶，均能有效抑制其增殖的作用，这表明GAS2具有促进/维持肿瘤细胞增值的功能。GAS2主要通过其N-端与Calpain2(钙蛋白酶)结合，C-端行使抑制Calpain2(钙蛋白酶)的活性的功能从而促进肿瘤细胞的增殖。GAS2的截短型突变体GAS2Δ171-313也可通过N-端与Calpain2(钙蛋白酶)结合，但却因为C端缺失，没有抑制Calpain2(钙蛋白酶)的活性的功能，因此是GAS2的显性负性突变体(GAS2DN)。但由于Calpain2存在于细胞内，外源性GAS2DN无法穿透细胞膜进入细胞内与Calpain2(钙蛋白酶)结合。多项研究表明GAS2(growth-arrest-specific2)在多种白血病中的异常高表达，也发现GAS2是维持CML的CD34+细胞的新调控因子，提示靶向GAS2可能改善多种类型白血病的治疗，也可能帮助清除白血病干/祖细胞。结果已发表(ZhouX,PloSOne,2014；9:e86195；SunL,ActaBiochimBiophysSin(Shanghai),2015；47:795.)。研究还发现RNA干扰及表达GAS2DN都能增强CML细胞株K562的IM敏感性，提示靶向GAS2可能增强白血病细胞的化疗敏感性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术研发GAS2DN中起到与Calpain2(钙蛋白酶)特异性结合作用的关键多肽，确定类GAS2小肽序列，提供一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，使其具有GAS2DN蛋白抑制功能，充当GAS2抑制剂使白血病患者获得治疗效果。一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn。所述多肽的N端与肉豆蔻酸连接，通过肉豆蔻酸修饰进入白血病细胞，抑制白细胞的增殖，用于制备治疗白血病的药物。.所述多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)多肽的合成a.将Fmoc-Asn(trt)wangResin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡，抽干；b.加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动抽干；c.向玻璃反应柱中加入适量DMF，通氮气搅拌鼓动抽干；d.将氨基酸混合溶液或保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入NMM，通氮气搅拌鼓动抽干；e.加入适量DMF洗涤，氮气搅拌鼓动抽干，得到颗粒状物质；f.取适量颗粒状物质于小试管中，加入Kaisertest试剂的A、B、C液各两滴，放入干式加热器中，加热，若溶液颜色微黄，颗粒状物质无色透明则为反应完全，重复上述步骤b-e,连接下一个氨基酸，直到连完最后一个氨基酸及肉豆蔻酸；g.向完成步骤f)的反应柱中，加入适量甲醇，氮气鼓动抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动抽干，得到合成的多肽树脂，装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥；2)多肽的切割向多肽树脂中，加入多肽切割液，放置于恒温环境下振荡；之后进行过滤，在滤液加入无水乙醚，搅拌后析出白色固体；向白色固体中加入无水乙醚，离心洗涤，真空干燥后得到的白色粉末，即为多肽的粗品；3)多肽的纯化取适量多肽的粗品，加入纯水和ACN超声溶解，滤膜过滤后取滤液；用高效液相色谱仪进行正向色谱柱进行梯度检测分析；制备色谱柱吸附和洗脱收集馏分；将收集的馏分进行检测，纯度合格后进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。进一步的，所述脱保护溶液由20％的六氢吡啶和80％的DMF配置而成。进一步的，所述保护氨基酸为Fmoc-Aa-oh形式的保护氨基酸，所述氨基酸混合溶液由保护氨基酸溶于DMF制成。进一步的，所述Kaisertest试剂的A液为80％的苯酚和20％的无水乙醇，B液为重蒸吡啶，C液为5克茚三酮和100ML无水乙醇。进一步的，所述多肽切割液的组成成分为：87.5％TFA，5％苯甲硫醚，2.5％苯酚，2.5％EDT和2.5％H2O。进一步的，所述3)多肽的纯化步骤如下：制备条件：波长：220nm流速：0.5-1.5ml/min制备柱：Gemini-NX5μC18110A,4.6*250mm流动相：A液：0.1％Trifluoroaceticin100％AcetonitrileB液:0.1％Trifluoroaceticin100％Watera)称量适量多肽的粗品于烧杯中，加入纯水和ACN超声溶解，待完全溶解后用0.45μ的滤膜过滤；b)取少量多肽的粗品于离心管中用纯水超声溶解至澄清过滤，用梯度10-100％检测分析；c)在制备条件下，平衡仪器约6分钟后停所有泵，将a)步骤中过滤后的滤液用进样阀进样，先执行30-90％的梯度20min，再执行100-0％的梯度，收集馏分；d)将收集的馏分进行检测，纯度合格的进行冷冻干燥，得到纯化后的多肽。有益效果：(1)本专利技术制备的多肽，具有抑制具有GAS2DN蛋白抑制功能，能够起到GAS2抑制作用，从而起到抑制白血病细胞的增殖的作用，但因GAS2DN无法穿透细胞膜进入细胞，即使有抑制白血病细胞的增殖的功能，也达不到抑制白血病细胞的增殖的效果，而本专利技术制备的多肽，通过与肉豆蔻酸连接，可以进入白血病细胞，达到抑制白血病细胞的增殖的效果；(2)本专利技术制备的多肽具有抑制白血病细胞增殖的作用，同时对正常细胞没有抑制作用，以该多肽为核心成分可研发出治疗白血病的新型靶向治疗药物，提供一种全新的治疗方式，减少副作用，减轻病人的痛苦，提高白血病的治愈率和生存率。尤其对于某些白血病亚型，如急性T淋巴细胞白血病细胞系(T-All)和急性髓细胞白血病细胞系(AML)，目前化疗效果不佳，也没有适用的靶向药物，本专利技术多肽可以有效的抑制上述两种白血病细胞，提示如以该多肽为核心成分研发出治疗白血病的新型靶向治疗药物，有可能填补在这些白血病治疗领域靶向治疗药物的空白；(3)研究发现RNA干扰及表达GAS2DN都能增强CM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，其特征在于，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：Lys‑Glu‑Ser‑Met‑Asp‑Ala‑Asn‑Lys‑Pro‑Thr‑Lys‑Asn‑Leu‑Pro‑Leu‑Lys‑Lys‑Ile‑Pro‑Cys‑Lys‑Thr‑Ser‑Ala‑Pro‑Ser‑Gln‑Ser‑Phe‑Phe‑Ala‑Arg‑Asp‑Asn‑Thr‑Ala‑Asn。

【技术特征摘要】
1.一种具有抑制白血病细胞增殖作用的多肽，其特征在于，所述多肽由37个氨基酸组成，氨基酸序列为：Lys-Glu-Ser-Met-Asp-Ala-Asn-Lys-Pro-Thr-Lys-Asn-Leu-Pro-Leu-Lys-Lys-Ile-Pro-Cys-Lys-Thr-Ser-Ala-Pro-Ser-Gln-Ser-Phe-Phe-Ala-Arg-Asp-Asn-Thr-Ala-Asn。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，多肽的N端与肉豆蔻酸连接，通过肉豆蔻酸修饰进入白血病细胞。3.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)多肽的合成a.将Fmoc-Asn(trt)wangResin树脂倒入反应柱中，加入DCM浸泡，抽干；b.加入适量脱保护溶液，通氮气搅拌鼓动抽干；c.向玻璃反应柱中加入适量DMF，通氮气搅拌鼓动抽干；d.将氨基酸混合溶液或保护氨基酸和HBTU加入反应柱中，再加入NMM，通氮气搅拌鼓动抽干；e.加入适量DMF洗涤，氮气搅拌鼓动抽干，得到颗粒状物质；f.取适量颗粒状物质于小试管中，加入Kaisertest试剂的A、B、C液各两滴，放入干式加热器中，加热，若溶液颜色微黄，颗粒状物质无色透明则为反应完全，重复上述步骤b-e,连接下一个氨基酸，直到连完最后一个氨基酸及肉豆蔻酸；g.向完成步骤f)的反应柱中，加入适量甲醇，氮气鼓动抽干，再加入适量DCM，氮气鼓动抽干，得到合成的多肽树脂，装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥；2)多肽的切割向多肽树脂中，加入多肽切割液，放置于恒温环境下振荡；之后进行过滤，在滤液加入无水乙醚，搅拌后析出白色固体；向白色固体中加入无水乙醚，离心洗涤，真空干燥后得到的白色粉末，即为多肽的粗品；3)多肽的纯化取适量多肽的粗品，加入纯水和ACN超声溶解，滤膜过滤后取滤液；将滤液用高效液相色谱仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱江，钟安，吕美琪，
申请(专利权)人：南京蜂瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32