一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2‑4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L‑抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。本发明专利技术所公开禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高，经济适用。

Preparation of yolk antibody against group A capsular antigen of Pasteurella avium

The invention discloses a preparation method of egg yolk antibody against group A of avian Pasteurella capsular antigen, which comprises the following steps: (1) immunizing hens of reproductive age with inactivated vaccine of group A of avian Pasteurella capsular antigen to obtain high immunity eggs; (2) collecting high immunity egg yolk, removing yolk membrane and crushing egg yolk liquid; (3) mixing the obtained egg yolk liquid with purified water at a volume ratio of 1:2_4; After stirring, the final concentration of ascorbic acid, 4-8% (m/v) propylene glycol and 3-6% (m/v) dextran sulfate were added. After fully stirring, the supernatant was collected by centrifugation at low temperature for 2-4 hours. (4) The supernatant collected was filtered and the yolk antibody solution was obtained. The invention discloses a preparation method of group A yolk antibody of avian Pasteurella capsular antigen, which has simple steps, high efficiency and yield, and is economical and applicable.

【技术实现步骤摘要】
一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法
本专利技术涉及一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
禽多杀性巴氏杆菌病又称为禽霍乱，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，PM)引起的一种急性、接触性败血传染病，分布在世界各地，对养禽业的发展有着严重的影响，根据菌株间抗原成分的差异，多杀性巴氏杆菌分为多个血清型，近年来，A菌株为国内主要流行血清型。预防控制该病的最有效途径是疫苗免疫，目前国内外常用的禽巴氏杆菌病疫苗是灭活疫苗，但常规灭活疫苗免疫具有保护率较低约80％左右，免疫谱窄(只对同型菌株具有较好的保护)、保护期短，费用高昂等缺点。卵黄抗体(IgY)是母禽被外来抗原刺激后，母禽血液中免疫球蛋白转移至其卵黄中对子代产生保护性作用的免疫球蛋白，是在卵黄内所产生的特异性抗体，其浓度远高于血清，并具有高度稳定性和生物学活性，这使应用卵黄抗体防病治病成为可能。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种纯度、收率高，活性强、易于制备与应用且经济的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术公开一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其包括以下步骤：(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2-4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L-抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。所述步骤(3)优选蛋黄液与纯化水的体积比为1:3；搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及5％(m/v)的硫酸葡聚糖；低温放置温度为4℃，放置时间为3小时；低温离心条件为5℃11000r/min离心30分钟。所述步骤(1)中的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗，其由禽巴氏杆菌标准菌种A群NCTC1502或C48-1制备，灭活疫苗含菌量最好大于1×1010CFU/mL。本专利技术所公开禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，步骤简单，效率及得率高，L-抗坏血酸、丙二醇、硫酸葡聚糖的组合可在高浓度液体中有效去除蛋黄中的其它成分，蛋黄液不需要加入过多的纯化水稀释，制得的卵黄抗体液无需浓缩即有较高的浓度，极大的简化了操作流程，耗时短，操作全程都维持在较低的温度，良好的保留了所制备卵黄抗体的活力，且L-抗坏血酸及丙二醇毒性低，可应用于注射剂，无需额外除去残留即可使用。所得的卵黄抗体纯度高，活力好，并意外的可在胃肠道中保持较好的活性，免疫方式除注射给药，也可与饲料混合口服给药，均可提供较好的免疫保护，经济适用。具体实施方式以下通过具体实施例再对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本专利技术上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本专利技术的范围内。用于免疫的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗可采用市售或自行制备，自行制备可应用现有的常规方法，不影响专利技术效果的实现。以下实施例所用的免疫的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗采用如下方式制备：a)菌种采用禽巴氏杆菌标准菌种C48-1。将菌种接种于加3％灭能鸡血清的脑心浸出液培养基复壮，然后通过鸡体一次，此菌株用于制备荚膜抗原和作为免疫鸡后的攻击菌株；b)生长在加3％灭能鸡血清的脑心浸出液于37℃0～4小时培养的菌液5毫升，接种入盛有加3％灭能鸡血清的含0.2％葡萄糖的脑心浸液琼脂培养基的克氏瓶内，置37℃培养18小时。经纯检后，注入2.5％食盐冷溶液，刮取培养瓶中的菌苔，然后置56℃水浴1小时。离心收集上清液，置4℃等渗食盐溶液透析48小时，透析液通过0.45μm微孔滤膜除菌),浓缩冻干，得荚膜抗原A，使用时用20％氢氧化铝凝胶液配置得灭活疫苗(以菌数计含菌量约为1.5×1010CFU/mL)。实施例1制备方法：(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1％(m/v)的L-抗坏血酸、4％(m/v)的丙二醇及3％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，8℃放置2h，8℃10000r/min离心20min，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例2制备方法：(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为3％(m/v)的L-抗坏血酸、8％(m/v)的丙二醇及6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，2℃放置4h，5℃10000r/min离心30min，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例3制备方法：(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及4％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，4℃，放置3小时；5℃11000r/min离心30分钟，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。实施例4制备方法：(1)给12～15周龄的海兰褐鸡皮下注射2mL禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫，共免疫3次，每相邻两次免疫的时间间隔为10d，在最后一次免疫后3d收集鸡蛋，即得高免鸡蛋；(2)将高免鸡蛋用75％酒精进行表面消毒，水清洗干净，分离出蛋黄，过60目尼龙筛去除卵黄膜和系带蛋黄，破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为2％(m/v)的L-抗坏血酸、6％(m/v)的丙二醇及5％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，4℃，放置3小时；5℃11000r/min离心30分钟，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。对比例1样品通过除步骤(3)不加L-抗坏血酸，其它操作同实施例4步骤所制备。对比例2样品通过除步骤(3)中不加丙二醇，其它操作同实施例4步骤所制备。对比例3样品通过除步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2‑4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L‑抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。

【技术特征摘要】
1.一种禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用禽巴氏杆菌荚膜抗原A群灭活疫苗免疫育龄母鸡，获得高免鸡蛋；(2)收集高免鸡蛋蛋黄，去除卵黄膜和破碎得蛋黄液；(3)将步骤(2)得到的蛋黄液与纯化水以1:2-4的体积比混合，搅拌均匀后加入终浓度为1～3％(m/v)的L-抗坏血酸、4～8％(m/v)的丙二醇及3～6％(m/v)的硫酸葡聚糖，充分搅拌后，低温放置2～4h，低温离心，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液过滤除菌后即得卵黄抗体液。2.如权利要求1所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于，所述步骤(3)中蛋黄液与纯化水以1:3的体积比混合。3.如权利要求1所述的所述的禽巴氏杆菌荚膜抗原A群卵黄抗体的制备方法，特征在于：所述步骤(3)中搅拌均匀后加入终浓度为2％(...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，谢秉超，杨球，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44