【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于植物中的基因组修饰的方法和组合物优先权声明和序列表的并入本申请要求于2016年6月28日提交的美国临时专利申请第62/355,715号的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。序列表的计算机可读形式与本申请一起通过电子提交方式提交，并且通过引用整体并入本申请。包含在名为“P34339WO00_SEQ.txt”的文件中的序列表(其大小为12,613字节(在中测量的)并于2017年6月26日创建)，以电子方式随同提交，并通过引用整体并入。专利
本公开涉及植物转化领域。提供了用于从土壤杆菌属(Agrobacterium)质粒转移DNA的T链的方法和组合物。还提供了使用土壤杆菌属介导的DNA的T链转移以促进转基因的模板化基因编辑和定点整合的方法和组合物。还提供了用于提高土壤杆菌属介导的转化的效率的方法。还提供了非土壤杆菌属介导的转化方法和组合物。
技术介绍
土壤杆菌属介导的转化利用根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)将从重组质粒合成的单链DNA转移至植物细胞。植物细胞的转化通常需要与根癌土壤杆菌共培养。将目标DNA序列整合到特别构建的DNA质粒中，其中目标DNA序列侧接有土壤杆菌属肿瘤诱导(Ti)质粒右边界DNA区域和左边界DNA区域。当内切核酸酶VirD2在右边界和左边界区域中使DNA质粒产生切口以释放单链转移DNA(也称为T-链)时，土壤杆菌属介导的转化过程开始。T链将位于右边界与左边界之间的转基因转移到靶向的植物细胞中，其中T链可以整合到基因组中(参见，例如，美国专利第5,034,322号；Pitzschke和Hirt.The...
【技术保护点】
1.一种向植物细胞的基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使所述植物细胞与能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中是基本上互补的两条T链的载体，a.其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或b.其中所述至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得所述RB1与位于所述载体中的所述LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2与位于所述载体中的所述LB2配对以启动(RB2)和终止(LB...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.28 US 62/355,7151.一种向植物细胞的基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使所述植物细胞与能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中是基本上互补的两条T链的载体，a.其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或b.其中所述至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得所述RB1与位于所述载体中的所述LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2与位于所述载体中的所述LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或c.其中所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中所述第一目标序列与所述第二目标序列基本上相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得所述第二目标序列相对于所述第一T链中的所述第一目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述第一目标序列和所述第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或d.其中所述根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中所述第一载体包含位于所述第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且其中所述第二载体包含位于所述第二载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或e.其中所述至少一种载体包含第一目标序列、与所述第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RBDNA序列和一个或多个任选的LBDNA序列，其中所述第一RBDNA序列(RB1)和第一LBDNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述第一目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体构型还包含位于所述载体中的第二RBDNA序列(RB2)和第二LBDNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中所述载体构型还包含位于所述载体中的第三RBDNA序列(RB3)和第三LBDNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体构型还包含位于所述载体中的第四RBDNA序列(RB4)和第四LBDNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得所述第二目标序列处于所述第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且所述由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在所述第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。2.一种向植物细胞的基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使所述植物细胞与两种或更多种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两条基本上互补的T-链的载体中的一种，a.其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中所述第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；或b.其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中所述第一载体包含位于所述第一载体中的RB1和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述第二载体包含位于所述第二载体中的RB2和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得所述目标序列处于所述第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中a.所述RB1与所述RB2是基本上同源的，并且所述LB1与所述LB2是基本上同源的；b.所述RB1与所述RB2是基本上同源的，并且所述LB1与所述LB2不是基本上同源的；c.所述RB1与所述RB2不是基本上同源的，并且所述LB1与所述LB2是基本上同源的；或d.所述RB1与所述RB2不是基本上同源的，并且所述LB1与所述LB2不是基本上同源的。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中a.所述RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列；b.所述RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列；c.所述RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQIDNO:1-13的序列；或d.所述RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQIDNO:4和SEQIDNO:12的序列具有至少80％同一性的序列。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中a.所述LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列；b.所述LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列；c.所述LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQIDNO:14-20的序列；或d.所述LB1和LB2中的至少一种包含与SEQIDNO:19具有至少80％同一性的序列。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述目标序列包含一个或多个表达盒。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码蛋白质的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述目标序列还包含至少一个同源臂DNA序列。9.如权利要求8所述的方法，其中所述目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。10.如权利要求8所述的方法，其中所述至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。11.如权利要求9所述的方法，其中所述侧接有同源臂的目标序列包含与所述植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的序列。12.如权利要求7所述的方法，其中所述非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。13.如权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。14.如权利要求13所述的方法，其中所述内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute和RNA引导的内切核酸酶。15.如权利要求14所述的方法，其中所述RNA引导的内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY和Cpf1核酸酶。16.如权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。17.如权利要求7所述的方法，其中所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述目标序列的至少一部分通过同源重组或通过非同源末端连接整合到所述植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的所述内源基因座的转录、减少的所述内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的所述目标序列的转录、减少的所述整合目标序列的转录或其任何组合。19.一种向植物细胞的基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使所述植物细胞与能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)的载体，并且其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于所述RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于所述RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在所述T链合成后退火以形成双链DNA。20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一目标序列还包含第一左同源臂DNA序列和第一右同源臂DNA序列，并且所述第二目标序列还包含第二左同源臂DNA序列和第二右同源臂DNA序列。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述植物细胞已包含位点特异性酶。25.一种土壤杆菌属细胞，其包含至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体。26.如权利要求25所述的土壤杆菌属细胞，其中a.所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；b.所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得所述RB1与位于所述载体中的LB1配对，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2与位于所述载体中的LB2配对，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的；c.所述至少一种载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中所述第一目标序列与所述第二目标序列基本上相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的第一右边界DNA序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·K·克里格尔，R·J·劳伦斯，Z·E·瓦格克希帕瓦拉，徐建平，叶旭东，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。