一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型制造技术

本发明专利技术公开了一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型，属于动物模型技术领域。本发明专利技术首次使用AAV‑cre病毒和Rosa‑tdTomato flox条件性基因敲除小鼠进行小鼠模型构建，并提供了在脊髓前角立体定位注射的方法和坐标，标记了脊髓前角运动神经元。本发明专利技术构建的小鼠模型模型为脊髓前角运动神经元轴突再生的研究提供了动物模型。

【技术实现步骤摘要】
一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型
本专利技术涉及一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型，属于动物模型

技术介绍
随着现代交通运输、体育活动、建筑工程的迅速发展，神经损伤尤其是脊髓损伤spinalcordinjury(SCI)日渐增加。脊髓是中枢神经系统(CNS)的重要组成部分，其主要功能是传送脑与外周神经之间的神经信息；同时，它也是许多反射活动的低级中枢。严重的脊髓损伤往往导致损伤平面以下的感觉功能、运动功能及括约肌功能均永久丧失，进而导致瘫痪。其较高的致残率和高昂的医疗费用，给患者的家庭乃至整个社会都带来了沉重的负担。据统计，我国每百万人口中，脊髓损伤的发病率达到40-60人次/年；由此可以估算出，我国因脊髓损伤导致瘫痪的患者超过百万人。脊髓损伤首先使神经轴突断裂，从而导致神经传导束的中断，也因此整个神经传导通路遭到了破坏。因为中断的神经轴突无法自行再生和修复，使得脊髓发生损伤之后，常遗留严重而又难以恢复的神经功能障碍。但是，在目前的医学领域范畴，对脊髓损伤却尚无有效的治疗手法。因此，对神经轴突的再生机制、以及如何促进轴突生长能力做进一步深入研究，对明确脊髓损伤的发病机制及临床治疗有着重大的意义。在轴突再生的研究中，建立一种可靠性高、重复性好的动物模型,对研究脊髓损伤具有十分重要的理论价值和临床意义。为了研究脊髓轴突再生，科学家们建立了许多类型的脊髓损伤模型，然而现在还没有用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的动物模型。因此，我们旨在建立一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的动物模型，为研究脊髓运动神经元轴突的再生奠定基础。在研究脊髓损伤后神经轴突的再生中，现有的动物模型是在小鼠(或大鼠)大脑皮层中立体定位注射病毒标记大脑皮层深层(V、VI层)的运动神经元(前运动神经元)，检测脊髓损伤后神经元轴突的再生情况。在神经信号的传导中，前运动神经元通过轴突把信号传递给位于脊髓前角的运动神经元(后运动神经元)，后运动神经元把接收到的信号通过轴突传递到神经肌肉接头，来控制肌肉的收缩从而控制下肢的运动。在脊髓轴突再生的研究中，目前常用的模型是用带GFP的病毒标记大脑皮层的前运动神经元，然后对标记的神经元轴突进行损伤，这种模型应用于前神经元轴突损伤后的再生研究。它的局限在于不能用于位于脊髓前角运动神经元轴突的再生研究。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型，为脊髓前角运动神经元轴突再生的研究提供了动物模型。本专利技术的第一个目的是提供一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型的构建方法，在Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠脊柱L1的前角部位注射AAV-Cre病毒。进一步地，所述的AAV-Cre病毒的滴度为1×1012～14。优选1×1013。进一步地，所述的AAV-Cre病毒的注射量为0.5～1.5ul。优选1ul。进一步地，所述的脊柱L1的前角部位为以小鼠脊髓中央管为中线，向左或向右0.4～0.6mm。优选以小鼠脊髓中央管为中线，向左或向右0.5mm。进一步地，所述的注射的方式为将针尾向小鼠头部倾斜25～35°向下进针0.8～1.2mm。优选将针尾向小鼠头部倾斜30°向下进针0.9-1.0mm。进一步地，所述的注射的时间为5～6min，停针5min，退针2～3min。进一步地，所述的Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠培养至6～8周。进一步地，所述构建方法具体包括如下步骤：(1)将Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠固定，然后对小鼠脊髓进行暴露处理；(2)选定小鼠脊柱L1的前角部位的位置，以小鼠脊髓中央管为中线，向左/右0.4～0.6毫米；(3)将0.5～1.5ul滴度为1×1012～14的AAV-cre病毒注射至步骤(2)选定的位置，注射方式为将针尾向小鼠头部倾斜25～35°向下进针0.8～1.2mm，注射时间为5～6min，停针5min，退针2～3min；(4)注射后对小鼠皮肤进行缝合。本专利技术的第二个目的是提供一种上述的方法构建得到的小鼠模型。本专利技术的第三个目的是提供上述的小鼠模型在脊髓前角运动神经元轴突损伤后再生研究中的应用。本专利技术中Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠购自Jacksonlab。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次使用AAV-cre病毒和Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠，并提供了在脊髓前角立体定位注射的方法和坐标，标记了脊髓前角运动神经元。本专利技术构建的小鼠模型模型为脊髓前角运动神经元轴突再生的研究提供了动物模型。附图说明图1为小鼠脊髓暴露流程；图2为AAV-cre病毒注射位置；图3为脊髓注射模式图；图4为注射AAV-cre病毒后脊髓前角Tomato蛋白的表达检测；其中，病毒注射部位的脊髓组织进行切片后进行细胞核染料DAPI染色；图5为运动神经元的特异性标记蛋白ChAT对组织进行染色后，脊髓前角中检测Tomato蛋白的表达；图6为背根神经节和坐骨神经中表达Tomato红色蛋白的运动神经元轴突检测；其中，Tuj1是神经元的特异性标记物，能够标记神经元的胞体和轴突；图7为被感染运动神经元的轴突进入肌肉运动终板；其中，α-BTX是神经肌肉接头的特异性标记蛋白，图中呈纺锤体形状。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1：脊髓前角定位注射AAV-cre病毒采用图1的方法，将小鼠脊髓进行暴露，然后按照如下方法在小鼠脊髓前角定位注射AAV-cre病毒：1、注射用针：所用材料是PCR微量注射玻璃管(Drummond，#5-000-1001-X10)，将玻璃管用拉针仪(NARISHIGE，PC-10)拉成注射用针。2、病毒：病毒滴度为1×1013，注射量为1ul。3、注射仪器：脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司)。4、模型用小鼠：Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠。5、注射步骤：将吸有1ulAAV-cre病毒的微量注射针安装在脑立体定位仪上，在小鼠脊柱L1的前角部位注射AAV-Cre病毒(图2)，注射坐标如下：以小鼠脊髓中央管为中线，向左/右0.5毫米，将针尾向小鼠头部倾斜30°向下进针0.9-1.0毫米(图3)，注射时间为5-6分钟，停针5分钟，退针2-3分钟，之后缝合皮肤，待2周后进行标记检测。实施例2：被AAV-cre病毒感染的神经元会表达Tomato红色荧光蛋白。首先我们在脊髓前角注射部位观察Tomato蛋白的表达情况，接着使用ChAT特异性抗体标记运动神经元，以检测运动神经元是否被标记。脊髓前角的运动神经元发出的轴突经背根神经节(dorsalrootganglion，DRG)传向坐骨神经，最终延伸至肌肉运动终板。因此，我们取脊髓、DRG，坐骨神经和肌肉，检测其中Tomato红色荧光蛋白的表达，以确认病毒成功感染脊髓前角的运动神经元。(1)Tomato蛋白在脊髓前角的表达检测。给Rosa-tdTomato小鼠脊髓前角注射AAV-cre病毒2周后，取组织进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察Tomato蛋白在脊髓前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型的构建方法，其特征在于，在Rosa‑tdTomato flox条件性基因敲除小鼠脊柱L1的前角部位注射AAV‑Cre病毒。

【技术特征摘要】
1.一种用于研究脊髓前角运动神经元轴突再生的小鼠模型的构建方法，其特征在于，在Rosa-tdTomatoflox条件性基因敲除小鼠脊柱L1的前角部位注射AAV-Cre病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AAV-Cre病毒的滴度为1×1012～14。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的AAV-Cre病毒的注射量为0.5～1.5ul。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脊柱L1的前角部位为以小鼠脊髓中央管为中线，向左或向右0.4～0.6m...

【专利技术属性】
技术研发人员：赛吉拉夫，马艳霞，王丰，张鸿程，齐士斌，马进进，张浩楠，徐金辉，秦绪祯，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32