一种发酵饲料的菌落计数方法技术

本发明专利技术涉及一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法，所述方法通过将发酵饲料稀释后的样品分别在含有那他霉素的MRS固体培养基、含有链霉素和青霉素的YPD培养基、以及LB培养基上进行计数，可将发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌的数量更加准确地统计，提高了发酵饲料中的单种微生物的计数准确性，并且操作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵饲料的菌落计数方法
本专利技术涉及微生物计数领域，具体而言，涉及对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法。
技术介绍
发酵饲料是在人工控制条件下，通过微生物自身的代谢活动，将植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子分解或转化，产生更能被畜禽采食、消化吸收且无毒害作用的饲料原料。研究表明，饲料经过发酵处理，可以提高其营养吸收水平，降解其原料中可能存在的毒素，且促进生长、维持动物体内微生态平衡、增强机体免疫力、防病治病等这些作用也可以得到体现。其中，微生物在这个发酵过程中起十分关键的作用。因此，评价发酵饲料的品质的指标之一就是发酵饲料中的活菌数。在发酵饲料中的酵母菌、芽孢杆菌及乳酸菌等有益菌数量极多，而有害菌(例如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)数量极低，不超过10cfu/g。因此，检测发酵饲料中的酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌的菌数则可表示其中的活菌数。现行的饲料中细菌总数的计数方法，仅仅能计算出细菌总数，并且通常存在较大的检测误差。若要分别对不同属的菌种进行计数，则需要结合生化检测，该方法费时费力，并且现行饲料标准中尚没有统一有效的计数方法保证菌落计数的准确性，无法将同类产品进行统一比较。平板菌落计数法是检测饲料中的酵母菌、芽孢杆菌及乳酸菌的常用方法之一。由于芽孢抗逆能力强，且菌落易在其它培养基中生长，影响乳酸菌和酵母菌的计数，因此现行的检测方法(如国标法[1]GBT13093-2006)并不能准确进行计数，而该值的准确性又直接关系到发酵饲料的质量好坏。因此，开发一种新的计数方法势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌准确地进行计数的方法，其中，所述方法包括：1)取发酵饲料并按照重量体积比1:8-1:10用无菌生理盐水制成饲料悬液；2)将所述悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释，得到稀释倍数为104、105和106的稀释液；3)取所述稀释倍数为104、105和106的稀释液并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注含有10-50ppm链霉素和10-25ppm青霉素的YPD培养基并进行混合，获得含菌的YPD平板，在28℃-32℃下培养24h-48h后对酵母菌进行计数；同时，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液加热至80℃-85℃并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注LB培养基并进行混合，获得含菌的LB平板，在28℃-32℃下培养24h-48h后对芽孢杆菌进行计数；另外，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液，分别涂布至含有100-500ppm那他霉素的MRS培养基的平板上，在36℃-38℃下培养24h-48h后对乳酸菌进行计数。本专利技术的有益技术效果如下：该方法适用于对乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行准确计数，可提高混合发酵饲料中的单种微生物的计数准确性，并且操作简便。附图说明图1为处于MRS培养基上的乳酸菌在显微镜下和通过肉眼观察到的形态。图2为处于LB培养基上的芽孢杆菌在显微镜下和通过肉眼观察到的形态。图3为处于YPD培养基上的酵母菌在显微镜下和通过肉眼观察到的形态。图4A-图4C分别示出了实施例1中用于计数的根据本专利技术的方法以及现行的国标方法得到的各平板上的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌经培养后的形态的照片。图5A-图5C分别示出了实施例2中用于计数的根据本专利技术的方法以及现行的国标方法得到的各平板上的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌经培养后的形态的照片。具体实施方式本文所述的“乳酸菌”是指能利用葡萄糖或乳糖发酵生成乳酸的细菌，在对其而言具有特异性的乳酸菌细菌(MRS)培养基上生长。当乳酸菌生长代谢出乳酸后，由于pH值降低，一般的微生物不容易在该培养基上生长，因而MRS培养基对乳酸菌具有一定的特异性。如图1右图所示，通常在MRS培养基上，37℃下培养24-48h后，生长的乳酸菌菌落具有如下特征：菌落直径为1～3mm，呈圆形，凸起，微白色，湿润，边缘整齐。由图1左图可以看出，在100倍的油镜视野下，乳酸菌呈现如下形态：短杆状，细胞成对或成链排列，两头钝圆，无芽孢，革兰氏阳性，直径0.5μm～1μm。本文所述的“芽孢杆菌”是指能形成芽孢(内生孢子)的杆状或球状细菌，在LB培养基上生长。如图2右图所示，通常在30℃下培养24-48h后，生长的芽孢杆菌菌落具有如下特征：单个的菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，边缘不规则中央有明显的芽孢体，而通常菌落连成一片，覆盖整个培养基。由图2左图可以看出，在100倍的油镜视野下，芽孢杆菌呈现如下形态：短杆状，成对排列，呈八字形，有端生或中生芽孢。本文所述的“酵母菌”是一种单细胞真菌，在对其具有特异性的酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基上生长。如图3右图所示，通常在30℃下培养24-48h后，生长的酵母菌菌落具有如下特征：菌落光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色。由图3左图可以看出，在40倍的显微镜视野下，酵母菌呈现如下形态：呈椭圆形或藕节形，细胞宽度2-6μm，长度5-20μm。在固态发酵饲料的发酵过程中通常同时使用乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行发酵。对发酵饲料中的各个菌属的菌落进行计数是评价发酵饲料的品质的指标之一。因此，计数结果的准确与否对于评价发酵饲料的品质而言非常重要。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法，其中，所述方法包括：1)取发酵饲料并按照重量体积比1:8-1:10用无菌生理盐水制成饲料悬液；2)将所述悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释，得到稀释倍数为104、105和106的稀释液；3)取所述稀释倍数为104、105和106的稀释液并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注含有10-50ppm链霉素和10-25ppm青霉素的YPD培养基并进行混合，获得含菌的YPD平板，在28℃-32℃下培养24h-48h后对酵母菌进行计数；同时，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液加热至80℃-85℃并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注LB培养基并进行混合，获得含菌的LB平板，在28℃-32℃下培养24h-48h后对芽孢杆菌进行计数；另外，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液，分别涂布至含有100-500ppm那他霉素的MRS培养基的平板上，在36℃-38℃下培养24h-48h后对乳酸菌进行计数。其中，上述方法中使用的MRS培养基、YPD培养基以及LB培养基均为本领域已知的常用培养基，可商购得到或者可参见例如如下文献中的记载进行配制：陈天寿主编，《微生物培养基的制造与应用》，中国农业出版社，1995年6月第1版；马乐好等主编，《微生物培养基实用手册》，吉林科学技术出版社，2006年3月第1版，但不限于此。另外，制备饲料的悬液和10倍稀释的操作均为本领域技术人员熟知的常规操作。本文中所述的“倾注”是具有本领域众所周知定义的制备用于培养细菌的平板的方法，其操作可为先将一定量的菌液倾注于培养皿中，然后再加入指定的培养基，快速混合均匀，待培养基凝固后，将含菌平板放入培养箱中培养，最后肉眼观察计数。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法，其中，所述方法包括：1)取发酵饲料并按照重量体积比1:8‑1:10用无菌生理盐水制成饲料悬液；2)将所述悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释，得到稀释倍数为104、105和106的稀释液；3)取所述稀释倍数为104、105和106的稀释液并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注含有10‑50ppm链霉素和10‑25ppm青霉素的YPD培养基并进行混合，获得含菌的YPD平板，在28℃‑32℃下培养24‑48h后对酵母菌进行计数；同时，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液加热至80℃‑85℃并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注LB培养基并进行混合，获得含菌的LB平板，在28℃‑32℃下培养24‑48h后对芽孢杆菌进行计数；另外，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液，分别涂布至含有100‑500ppm那他霉素的MRS培养基的平板上，在36℃‑38℃下培养24‑48h后对乳酸菌进行计数。

【技术特征摘要】
1.一种对发酵饲料中的乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌进行计数的方法，其中，所述方法包括：1)取发酵饲料并按照重量体积比1:8-1:10用无菌生理盐水制成饲料悬液；2)将所述悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释，得到稀释倍数为104、105和106的稀释液；3)取所述稀释倍数为104、105和106的稀释液并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注含有10-50ppm链霉素和10-25ppm青霉素的YPD培养基并进行混合，获得含菌的YPD平板，在28℃-32℃下培养24-48h后对酵母菌进行计数；同时，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液加热至80℃-85℃并分别加入培养皿中，向已加入所述稀释液的各培养皿中倾注LB培养基并进行混合，获得含菌的LB平板，在28℃-32℃下培养24-48h后对芽孢杆菌进行计数；另外，取等量的所述稀释倍数为104、105和106的稀释液，分别涂布至含有100-500ppm那他霉素的MRS培养基的平板上，在36℃-38℃下培养24-48h后对乳酸菌进行计数。2.如权利要求1所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟毅，焦琳，安泰，郑晓卫，陈博，卢宗梅，王博，陈影，金渭武，
申请(专利权)人：吉林中粮生化有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生物化学安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22