一种产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种产β‑胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法，首先在解脂亚罗酵母中敲除β‑胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的3‑磷酸甘油脱氢酶gut2基因，然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的β‑羟‑β‑甲戊二酸合成酶erg13基因，在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因；再游离表达解脂亚罗酵母内源的己糖激酶Hxk基因，筛选阳性转化子，得到产β‑胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株，该菌株经发酵培养，并提取分离，纯化β‑胡萝卜素，β‑胡萝卜素含量可以达到26.6mg/g细胞干重。

【技术实现步骤摘要】
一种产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法
本专利技术属于代谢工程和组合生物学
，具体涉及一种生产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。
技术介绍
β-胡萝卜素是存在于胡萝卜、枸杞等绿色蔬菜和黄色、橙色水果中的一种天然类胡萝卜素。在自然界有着广泛分布的β-胡萝卜素主要以全反式结构存在，包含着多个不饱和的共轭多烯双键，可以与自由基发生不可逆的氧化还原反应，得以具达到淬灭自由基、抗氧化、抑制单线态氧等的效果，并具有防癌、抗癌、延缓衰老等功能。从结构上看，一个β-胡萝卜素分子相当于两个分子的维生素A，作为已通过GRAS(美国FDA评价食品添加剂的安全性指标)的营养色素，β-胡萝卜素是安全的维生素A的来源，在人体内大量堆积不会影响健康，我国也作为营养增补剂和营养色素被列入《食品添加剂使用卫生标准GB-2760-96》。β-胡萝卜素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。相比于前两种生产方式，微生物发酵生产β-胡萝卜素具有不受光照、气候，场地等环境条件的限制，生产周期短，原料低廉易获取，加之产品具有安全性高、易纯化和着色力强等特点。β-胡萝卜素是一种脂溶性色素，它存储于脂质体中，而酿酒酵母是一种非产油酵母，积累的油脂量小于细胞干重的3％，这也限制了酿酒酵母作为表达宿主的应用；因此，寻找一种更具有优势的微生物势在必行。CN108359616A公开了一种β-胡萝卜素高产菌种及其应用，借助基因组装改造方法，将外源crtE、crtI和crtYB三个基因整合到酿酒酵母基因组中，构建了异源β-胡萝卜素合成途径，并敲除酵母基因组中YEL013W基因和YER042W基因，然后进行发酵，收集发酵培养物，提取β-胡萝卜素，结果显示该酿酒酵母中和β-胡萝卜素的生产能力显著提高。CN108118007A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌，通过基因工程方法向耶罗维解脂酵母引入来源于三孢布拉霉carRA基因和carB基因，进一步增强双香儿基焦磷酸合酶(GGS)和3-羟基-3-甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG-CoAcatareductase)的表达，敲除3-磷酸甘油脱氢酶(gut2)与过氧化物酶(Pox2)，获得了异源表达β-胡萝卜素的耶罗维解脂酵母菌株，发酵结果显示，该菌株发酵条件简单，β-胡萝卜素产量较高。CN105087408A公开了一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株，该专利技术酵母菌株基因组上的GAL1、GAL7、GAL10基因被ERG12、tHMG1、ERG8基因替换掉；GAL80基因被MVD1、ERG10、IDI1基因替换；ERG9基因的启动子被替换；表达来源于三孢布拉霉的carG、carB和carRA基因，经过密码子优化，并优化酵母发酵培养基的碳源(葡萄糖、甘油和乙醇)，结果显示乙醇作为碳源时可以明显促进β-胡萝卜素的合成，经发酵培养，最高可以产生64mg/Lβ-胡萝卜素。CN105779319A公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用，通过选择特定的组成型启动子组合，搭配红发夫酵母来源的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶双功能酶基因CrtYB、GGPP合酶CrtE、八氢番茄红素去饱和酶CrtI，以及特定的酵母内源基因，经模块化设计整合至酵母菌株基因组上并同源重组敲除ypl062w基因，获得一株全新的无需诱导剂的重组菌株，经发酵培养后，β-胡萝卜素产量为157.7mg/L(21mg/gDCW)。CN103865817A公开了一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，主要步骤如下：利用来自红发夫酵母中β-胡萝卜素生产相关基因crtE、crtYB、crtI构建基因表达模块，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块，所述的表达模块包括基因上游的启动子和下游的终止子。将外源基因片段同时转入酵母细胞内，通过同源整合到酵母基因组中，筛选获得阳性转化子，经发酵培养，β-胡萝卜素产量约6mg/gDCW。尽管目前已经有很多利用大肠杆菌和酿酒酵母合成β-胡萝卜素的报道，但是仍然没有相关的菌株被应用于工业化生产，究其原因，可能有以下几点：(1)β-胡萝卜素合成关键酶(八氢番茄红素脱氢酶，八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶)自身活性较低，异源表达后胡萝卜素合成量不高；(2)大肠杆菌会产生细胞毒素，用它做表达宿主生产胡萝卜素时存在食品安全风险；(3)β-胡萝卜素是一种脂溶性色素，它存储于脂质体中，而酿酒酵母是一种非产油酵母，积累的油脂量小于细胞干重的3％，这也限制了酿酒酵母作为表达宿主的应用；因此，增加脂质体的产生有助于β-胡萝卜素提高，寻找一种更具有优势的微生物势在必行。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种产β-胡萝卜素的基因工程菌株及其构建方法。解决上述技术问题所采用的产β-胡萝卜素的基因工程菌株由下述方法构建得到：首先在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因，然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因，得到产β-胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。上述在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因的方法为：以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物gut2-up-F和gut2-up-R，用保真酶PfuPCR扩增gut2基因的上游同源臂，利用引物gut2-down-F和gut2-down-R，用保真酶PfuPCR扩增gut2基因的下游同源臂；将gut2基因的上游同源臂插入到质粒pUra3的ApaI/SpeI双酶切位点，得到质粒pUra3-gut2-up；将gut2基因的下游同源臂插入到质粒pUra3-gut2-up的NdeI/SpeI双酶切位点，得到质粒pUra3-gut2-up&down；将质粒pUra3-gut2-up&down用限制性内切酶ApaI进行线性化后，用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组中，得到敲除gut2基因的解脂亚罗酵母，即菌株Po1f(△gut2)。上述游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为：以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R，用保真酶KDplusPCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因，将扩增的erg13基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI，得到质粒pJN44-erg13；以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R，用保真酶KDplusPCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因，将扩增的erg13基因插入到质粒pJN44-erg13的单酶切位点SpeI，得到质粒pJN44-erg13-erg13。上述在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为：以质粒pJN44-erg13-erg13为模板，利用引物erg13-assembly-EcorI-F和erg13-assembly-spHI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产β‑胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于：首先在解脂亚罗酵母中敲除β‑胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因，然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因，得到产β‑胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。

【技术特征摘要】
1.一种产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于：首先在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因，然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因，再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因，得到产β-胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。2.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因的方法为：以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物gut2-up-F和gut2-up-R，用保真酶PfuPCR扩增gut2基因的上游同源臂，利用引物gut2-down-F和gut2-down-R，用保真酶PfuPCR扩增gut2基因的下游同源臂；将gut2基因的上游同源臂插入到质粒pUra3的ApaI/SpeI双酶切位点，得到质粒pUra3-gut2-up；将gut2基因的下游同源臂插入到质粒pUra3-gut2-up的NdeI/SpeI双酶切位点，得到质粒pUra3-gut2-up&down；将质粒pUra3-gut2-up&down用限制性内切酶ApaI进行线性化后，用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组中，得到敲除gut2基因的解脂亚罗酵母，即菌株Po1f(△gut2)；上述的质粒pUra3的碱基序列如SEQIDNo.1所示；上述各引物序列如下：gut2-up-F：AGCTAGGGCCCGGGTTGGACAATATACAAATGgut2-up-R：ATGCAGCATGCTTGTTTGGGGTGGTGGGTgut2-down-F：ATGCGACTAGTCTGTATAGTAAAAGCGTATAGCCgut2-down-R：AGCGACATATGTCGTATAACTTGTAAGTATACAGTAACT。3.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为：以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R，用保真酶KDplusPCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因，将扩增的erg13基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI，得到质粒pJN44-erg13；以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板，利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，孟永宏，刘梁，钱亚丹，杨凡，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61