一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用技术

本发明专利技术公开了一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR‑T细胞的方法及该CAR‑T细胞和应用。本发明专利技术还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸，及表达所述嵌合抗原受体的重组表达载体。本发明专利技术将脐血作为γδT细胞来源，将γδT细胞从脐血中分离，高效扩增后，通过将本发明专利技术中装载嵌合抗原受体的慢病毒载体转导T细胞可得到CAR‑γδT细胞，从而获得能够高效并且特异性地杀伤相关抗原阳性的肿瘤细胞或其他感染性细胞，本发明专利技术将在肿瘤细胞治疗和免疫治疗中发挥作用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用
本专利技术属于细胞治疗及生物制药领域；具体涉及一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用。
技术介绍
CAR-T全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一，为肿瘤患者带来了新的希望。但是CAR-T细胞免疫治疗存在着一些需要改进的地方，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效，研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。人的T淋巴细胞根据其细胞表面受体(TCR)结构的不同，可以分为αβ和γδT细胞两大类，根据γ链和δ链的结构差异，γδT细胞又可以分Vδ1和Vδ2两个亚群。由于γ、δ链结构的不同，各亚群的功能也有差异，比如Vδ2细胞亚群就具有抑制病菌感染及抗肿瘤的特性。γδT细胞最大的特点是共表达TCRγδ链及NK细胞的重要受体NKG2D，因此γδT细胞兼具了T细胞和NK细胞的功能。γδT细胞除了能以非MHC分子限制性的方式直接识别和杀伤肿瘤细胞以及病菌感染的细胞外，还可以通过分泌各种细胞因子来活化其他的免疫细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、CD8+T淋巴细胞等。相比患者自体免疫细胞，来自健康人的同种异体免疫细胞具有更大的优势，而γδT细胞由于其对癌细胞的识别不需MHC分子的参与，可以直接选择性识别、杀伤癌细胞，更重要的是，不同人来源的γδT细胞没有排异性。γδT细胞激活后具有抗多种肿瘤细胞的细胞毒活性。γδT细胞以MHC非限制性的方式识别多种肿瘤相关抗原，通过凋亡诱导蛋白配体途径Fas-FasL和相关凋亡诱导配体受体诱导肿瘤细胞凋亡而分泌大量的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2，作用于肿瘤细胞及其微环境，其中IFN-γ是主要细胞因子，具有多种抗肿瘤作用如直接抑制肿瘤生长、阻断血管生成和刺激的巨噬细胞。IFN-γ成为在γδT细胞介导的抗肿瘤反应中的关键细胞因子；通过经抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用和穿孔素-颗粒酶B杀伤肿瘤细胞；通过某些膜表面受体如FcγR，经抗体依赖的细胞介导的细胞毒性而发挥细胞毒作用；作为抗原提呈细胞(antigen-presentingcells，APC)，发挥提呈抗原作用；脐血作为γδT细胞来源，有着诸多优势，作为异体免疫治疗，细胞来源健康人的脐血，激的反应很低，但是由于γδT细胞发育不成熟，多为幼稚细胞，所以免疫原性低移植后发生急性慢性GVHD的几率低、程度轻；具有广谱性，可选择性杀伤肿瘤细胞；易于体外培养，纯度可高于95％，能够大量冻存，即时即用；同种异体γδT细胞体外扩增不仅可以显著延长细胞的存活时间，还可以显著增加具有杀伤功能的γδT效应细胞的比例，提高γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。综上所述，脐血能成为异体CAR-γδT细胞比较理想的来源，即为脐血中γδT细胞功能健康、安全、易扩增、成本低、无毒性副作用、无需基因改造等，其应用前景更加广阔。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法。为了达成上述的目的，本专利技术提供了一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法，通过将脐血来源的单个核细胞分选γδT细胞，以及基因修饰，使其带上嵌合抗原受体，增强其在抗肿瘤中的靶向及毒性作用。可选或优选的，所述的脐血来自于足月产的健康婴儿的脐带和胎盘，无家族遗传病史，产妇无传染病史，胎儿健康产程顺利。本专利技术中所述的γδT细胞指来源于脐血单个核细胞为脐血中的γδT细胞。可选或优选的，所述γδT细胞来源于脐血单个核细胞。可选或优选的，所述方法包括质粒构架的选择、酶切位点、靶点、基因重组及制备。可选或优选的，所述CAR-γδT细胞特异性识别的抗原为肿瘤特异性抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫的蛋白抗原、或寄生虫的糖蛋白抗原。所述肿瘤特异性抗原为：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、LeY、MAGE-A1、间皮素、MUC1、NKG2Dligands、瘤胎抗原、PSCA、PSMA、TAG-72、或VEGF-R2。可选或优选的，所述CAR的结构包括依次连接的SP、scFv、CD8铰链区、CD19-CD3ξ、RRE-Cppt/CTS-EF1α和CD3ζ。该CAR为第三代，不仅包含CD3ζ信号域，还包括两个共刺激信号分子CD28TM+ICD、4-1BB，共刺激信号分子解决了CAR-NK细胞作用不持久等问题，而CD8铰链区、scFv(胞外抗原识别域，通常为单链抗体，也可以是多肽或其他蛋白)、SP(信号肽)同第一代。其中SP和scFv位于胞外，CD19-CD3ξ、RRE-Cppt/CTS-EF1α和CD3ζ位于胞内。可选或优选的，所述CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。可选或优选的，SP氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。可选或优选的，scfv氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。可选或优选的，CD8hinge氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。可选或优选的，CD28跨膜域氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。可选或优选的，胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3zeta组成,氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。可选或优选的，CAR的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。可选或优选的，所述的方法，包括以下步骤：(1)重组慢病毒载体构建和制备：采用OverlapPCR扩增获得带有酶切位点NotI-HF和BamHI-HF的片段RRE-Cppt/CTS-EF1α-CD19-CD3ξ；(2)CAR慢病毒的制备:将质量比为PTK-mCD19:pMDLg:pRSV:pMD2.G＝12:10:5:6)的320μg混合质粒接入130.0-140.0×106数目的293T细胞，培养3天后，收集细胞培养上清液。(3)脐血单个核细胞分离提取：取脐血，通过密度梯度离心获取单个核细胞；(4)γδT细胞的分选和扩增：使用CD56MicroBeads，human，去除脐血单个核细胞中CD56阳性细胞，γδT细胞使用T细胞完全培养液，500IU/mL的IL-2，唑来膦酸5μM；(5)特异性扩增γδT细胞并转导CAR慢病毒：γδT细胞和Lenti3-mCD19CAR慢病毒以MOI为2进行转导。(6)CAR-γδT细胞体外杀伤功能检测：钙黄绿素检测法对PTK-mCD19CAR-γδT细胞进行体外杀瘤功能检测。本专利技术还提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过上述任一所述的方法制得。本专利技术还提供了上述CAR-T细胞在制备用于治疗对应于CAR-T中嵌合抗原的种类的药物中的应用。通过将本专利技术的嵌合抗原受体表达于脐血来源的γδT细胞中可使得到的CAR-T细胞能够高效并且特异性杀伤特定的恶性肿瘤细胞，并且能消除个体间的排斥性，安全性更好。附图说明图1是重组慢病毒载体BRD-PTK-mCD19-0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR‑T细胞的方法，其特征在于，通过将脐血来源的单个核细胞分选γδT细胞，以及基因修饰，使其带上嵌合抗原受体，增强其在抗肿瘤中的靶向及毒性作用。

【技术特征摘要】
1.一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，通过将脐血来源的单个核细胞分选γδT细胞，以及基因修饰，使其带上嵌合抗原受体，增强其在抗肿瘤中的靶向及毒性作用。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述γδT细胞来源于脐血单个核细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括质粒构架的选择、酶切位点、靶点、基因重组及制备。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAR-γδT细胞特异性识别的抗原为肿瘤特异性抗原、病毒抗原、细菌抗原、寄生虫的蛋白抗原、或寄生虫的糖蛋白抗原。所述肿瘤特异性抗原为：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、LeY、MAGE-A1、间皮素、MUC1、NKG2Dligands、瘤胎抗原、PSCA、PSMA、TAG-72、或VEGF-R2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAR的结构包括依次连接的SP、scFv、CD8铰链区、CD19-CD3ξ、RRE-Cppt/CTS-EF1α和CD3ζ。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。7.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，顾潮江，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42