一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，包括以下步骤：1）组织块放入预冷无菌的培养液中处理；2）组织清理并切碎组织；3）消化处理；4）无菌细胞滤器过滤，得到消化过滤液并低温放置；5）用胶原酶冲洗无菌细胞滤器，搜集入离心管；6）将离心管平放于震荡箱内充分震荡；7）合并4）和6）步消化液，离心，弃上清液；8）充分吹打重悬细胞沉淀；9）分离传代；10）磁珠分选。本发明专利技术的有益效果：能够延长组织离体时间，提高细胞生长效率，缩短时间周期，纯化效率高，为宫颈癌基础研究提供新型高效方案。

【技术实现步骤摘要】
一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法
本专利技术涉及现代生物
，具体来说，涉及一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法。
技术介绍
世界范围内，宫颈癌（cervicalcancer，CC）为仅次于乳腺癌发病率第二的女性恶性肿瘤，众所周知，高危型HPV持续感染为致病因素，虽然在HPV疫苗推广十年的临床实践中使CIN≥III患病率下降至少50%（美国临床肿瘤协会报告，2016），然而由于大规模筛查和一级预防普及差异，同时缺乏行之有效的HPV+消退策略，宫颈癌仍是最主要的女性生殖系统肿瘤致死疾病。中国国家癌症中心撰文（CancerstatisticsinChina，2015）显示，宫颈癌发病率达99/100，000人，死亡31/100，000人，严重威胁着我国女性身心健康，对于该病发病机制的研究仍具有重大意义，因此，研究模型的建立则为研究基础。目前，宫颈癌细胞株包括广为使用的Hela（宫颈腺癌来源），及宫颈鳞癌来源SiHa，CaSki，C4-1及C33A，相较与其他癌种细胞株，种类较少，不能充分满足研究所需。原代细胞培养作为优良的实验模型，近30年来为研究者探究，然而宫颈存在于人体自然腔道，为非无菌环境，同时宫颈癌患者多合并病灶感染，多种菌群生存，且宫颈肿瘤组织包含细胞成份多样，如癌细胞，癌相关成纤维细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，血管内皮细胞及血细胞，为原代细胞分离培养的成功率及肿瘤细胞的纯化造成了研究屏障。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，能够延长组织离体时间，提高细胞生长效率，缩短时间周期，纯化效率高，为宫颈癌基础研究提供新型高效方案。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，包括以下步骤：1）将切除后的组织块放入预冷的培养液中，组织块直径大小达0.8cm，并低温放置，使组织处于无菌、低温和富有营养的环境中运回实验室，延长组织的处理时间，为组织取材及实验准备工作争取时间；2）在超净台内用纱布轻拭组织块血液并冲洗，清理后的组织块放入加有0.5mL培养液的6cm培养皿中，将组织在培养液中切碎为1mm×1mm×1mm的碎块，保障在切碎组织块时间内组织保持营养及湿润状态，组织切碎大小决定消化程度；3）向步骤2）中所述碎块组织中加入2ml消化液，放置培养箱内进行消化处理，得到含细胞悬液的消化液，观察组织解离情况，如果成纤维含量高，组织块硬，则延长消化时间，组织呈现粘稠状方可终止反应；4）将步骤3）中所述含细胞悬液的消化液用100um无菌细胞滤器过滤至装有2mL胎牛血清的50mL试管内，并用PBS冲洗，得到含胎牛血清的消化过滤液，并低温放置，使细胞处于低温环境；5）将步骤4）中所述100um无菌细胞滤器倒扣在原培养皿上，用0.2%I型胶原酶对所述100um无菌细胞滤器的滤网进行冲洗，使滤网上粘稠组织全部冲入培养皿中，共使用6mL的0.2%I型胶原酶，将冲洗液转移到15mL离心管，使未消化组织转移离心管进一步消化；6）将步骤5）中所述离心管平放于震荡箱内充分震荡，使剩余组织得到充分的消化，得到组织碎片消化液；7）将步骤4）中所述含胎牛血清的消化过滤液加入至步骤6）中所述组织碎片消化液中，离心，并弃去上清液，得到细胞沉淀；8）用培养液充分吹打重悬细胞沉淀，细胞计数板计数，将获得的细胞移至培养箱中培养；9）分离传代，细胞呈现鹅卵石样外观；10）细胞进行EpCAM/CD326磁珠分选，CD326+为纯宫颈癌鳞状上皮癌细胞，CD326-则包含宫颈鳞状上皮癌细胞和少量成纤维细胞。进一步的，步骤1)、步骤2)和步骤8)中所述培养液为DMEM高糖培养液+5%FBS+1%抗生素+HEPES10mM/mL、DMEM/F12+10%FBS+1%抗生素或DMEM-高糖培养液中的一种。进一步的，步骤2)中所述低温放置为4℃冰箱或冰袋上存放。进一步的，步骤2)中所述清理采用PBS+10%抗生素冲洗。进一步的，步骤3)中所述消化液为含EDTA的0.05%胰蛋白酶，消化时间为15-30min。进一步的，步骤3)和步骤8)中所述培养箱的培养条件为5%CO2、37℃。进一步的，步骤6)中所述震荡箱的37℃、转速180r/min，震荡时间为45-60min。进一步的，步骤10）中所述磁珠分选为EpCAM/CD326阳性肿瘤细胞。本专利技术的有益效果：将切除后的组织块放入预冷无菌的培养液中，并低温放置，能够延长组织离体时间；将无菌细胞滤器的滤网冲洗干净，充分消化能够提取高成活多数量的宫颈癌肿瘤原代细胞；提取的原代细胞细胞生长效率高，缩短时间周期，纯化效率高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织原代细胞分离培养流程示意图；图2是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本磁珠分选示意图；图3是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织的HE染色结果图；图4是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织成份比例检测结果图；图5是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本分离的培养观察结果图；图6是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本磁珠分选培养后的鉴定结果图；图7是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本AE1+alpha-SMA、AE1+P16、P16+HPV16/18-E6的表达情况结果图。图7A为宫颈鳞癌组织细胞标本AE1+alpha-SMA的表达情况；图7B为宫颈鳞癌组织细胞标本AE1+P16的表达情况；图7C为宫颈鳞癌组织细胞标本P16+HPV16/18-E6的表达情况；图8是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本磁珠分选EpCAM/CD326+细胞纯度检测结果图；图9是多组根据本专利技术实施例1所述的方法磁珠分选的EpCAM/CD326+细胞癌干细胞标志物的检测表达比例统计图；图10是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本磁珠分选EpCAM/CD326-多色流式细胞标志物分析结果图；图11是多组根据本专利技术实施例1所述的方法磁珠分选的EpCAM/CD326-成纤维细胞（Vimentin+）标志物的检测表达比例统计图；图12是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本14d细胞克隆形成情况结果图；图13是根据本专利技术实施例1所述的宫颈鳞癌组织细胞标本分选EpCAM/CD326+，EpCAM/CD326-及未分选细胞进行人宫颈癌组织分离细胞Populationdoublingtime的比较结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11）将切除后的组织块放入预冷处理的放置DMEM/F12+10%胎牛血清+1%抗生素的培养液中，在4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将切除后的组织块放入预冷培养液中，并低温放置；2）在超净台内对组织进行清理，清理后的组织块放入加有培养液的培养皿中，将组织切碎为1mm×1mm×1mm的碎块，得到碎块组织；3）向步骤2）中所述碎块组织中加入消化液，放置培养箱内进行消化处理，得到含细胞悬液的消化液；4）将步骤3）中所述含细胞悬液的消化液用100um无菌细胞滤器过滤至装有胎牛血清的试管内，冲洗得到含胎牛血清的消化过滤液，并低温放置；5）将步骤4）中所述100um无菌细胞滤器倒扣在培养皿上，用0.2%I型胶原酶将所述100um无菌细胞滤器的滤网冲洗干净，将冲洗液转移到离心管；6）将步骤5）中所述离心管平放于震荡箱内充分震荡，得到组织碎片消化液；7）将步骤4）中所述含胎牛血清的消化过滤液加入至步骤6）中所述组织碎片消化液中，离心，并弃去上清液，得到细胞沉淀；8）用培养液充分吹打重悬细胞沉淀，将获得的细胞移至培养箱中培养；9）分离传代；10）磁珠分选。

【技术特征摘要】
1.一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将切除后的组织块放入预冷培养液中，并低温放置；2）在超净台内对组织进行清理，清理后的组织块放入加有培养液的培养皿中，将组织切碎为1mm×1mm×1mm的碎块，得到碎块组织；3）向步骤2）中所述碎块组织中加入消化液，放置培养箱内进行消化处理，得到含细胞悬液的消化液；4）将步骤3）中所述含细胞悬液的消化液用100um无菌细胞滤器过滤至装有胎牛血清的试管内，冲洗得到含胎牛血清的消化过滤液，并低温放置；5）将步骤4）中所述100um无菌细胞滤器倒扣在培养皿上，用0.2%I型胶原酶将所述100um无菌细胞滤器的滤网冲洗干净，将冲洗液转移到离心管；6）将步骤5）中所述离心管平放于震荡箱内充分震荡，得到组织碎片消化液；7）将步骤4）中所述含胎牛血清的消化过滤液加入至步骤6）中所述组织碎片消化液中，离心，并弃去上清液，得到细胞沉淀；8）用培养液充分吹打重悬细胞沉淀，将获得的细胞移至培养箱中培养；9）分离传代；10）磁珠分选。2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌肿瘤原代细胞分离及培养方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴令英，张媛媛，安菊生，李宁，李楠，黄曼妮，孙阳春，王文鹏，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：北京,11