一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法技术

本发明专利技术公开了一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，具体是将小球藻与一种固氮菌(Mesorhizobium sp.)按照一定比例进行共培养，小球藻在生长过程中释放的氧气和胞外代谢物可以被细菌生长所消耗，细菌则可以代谢生成二氧化碳供藻细胞光合利用，同时释放维生素、糖肽类等生长刺激因子促进小球藻生长。另外，利用固氮菌对氮元素的固定能力，可以实现氮元素的限制性供给，这样既可以保证小球藻的正常生长，又可以实现藻细胞的高效产油。

【技术实现步骤摘要】
一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法
本专利技术涉及生物能源及微藻油脂
，具体涉及一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法。
技术介绍
能源与环境是人们共同关心的重要领域。随着化石燃料的大量使用，能源危机和温室效应问题日益突出，因此开发可再生、无污染的新型能源越来越受到人们的关注。生物能源又称绿色能源，是指从秸秆、大豆、玉米和微藻等生物质原料中获取的能源，主要包括沼气，生物氢气和生物柴油等。发展清洁高效的生物能源技术，对于改善能源消费结构、解决能源与环境的突出问题具有重要意义。目前生物能源已经发展到第三代，而第三代生物能源的原料之一就是微藻。微藻由于生长周期短、光合效率高、油脂含量高及不占用农业耕地等特点被视为新型生物柴油的首选原料之一。高含油量,特别是高中性脂含量是微藻作为生物柴油原料来源的重要优势。微藻细胞通过光合作用吸收CO2的同时可以生成不饱和脂肪酸、蛋白质和天然色素等物质，同时藻细胞内积累的甘油三酯(TAG)与甲醇等经过转酯化反应可以转化成含硫量低、安全性好、燃烧性能高的生物柴油,剩余的甘油骨架则可以通过加氢转化形成生物乙醇，因此微藻被认为是生产生物柴油和生物产品最有希望的原料之一。然而目前微藻产油还存在几个严重的限制因素，其中问题之一是微藻含油藻株的生长缓慢性质及其生物量和油脂积累模式的相互不协调性。在大多数微藻中，高脂质含量通常以营养缺失条件下细胞的生物量停止生长为代价。缺氮胁迫培养是目前诱导微藻油脂积累最有效也是最常见的方式，但是氮元素对藻细胞的生长必不可少，在缺氮环境中藻细胞的生长会受到很大影响，这就造成了“缺氮产油”及“生长需氮”之间的矛盾。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过藻菌共培养提高小球藻生物量和油脂含量的方法，该方法将小球藻与固氮菌B2.3按照一定比例进行共培养，藻菌共培养能够在BG11缺氮培养基中实现小球藻正常生长和高效产油，显著提高了藻细胞的生物量和微藻油脂质量，为微藻生物柴油的规模化生产提供理论基础。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：将小球藻(Chlorellavulgaris)与固氮菌B2.3(Mesorhizobiumsp.)按照一定初始比例进行共培养。在藻菌共培养体系中，微藻能够为微生物的生长提供所需氧气和养分，而微生物可以消耗藻类光合作用释放的氧气并产生CO2供微藻利用，同时能够消耗胞外多聚物中的多糖等物质来减少其对藻细胞生长的抑制作用。另外，固氮菌B2.3可以固定环境中的氮元素供小球藻生长利用，这样既可以保证小球藻的正常生长，还可以实现藻细胞的高效产油，具体培养方法如下：(1)首先将小球藻在BG11培养基中培养至对数生长期，随后藻细胞用离心机8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11缺氮培养基进行悬浮以去除培养基中的氮源且将OD750调至为1；(2)取40mL小球藻藻液接种至500mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的B2.3菌株(OD600调至为1)分别按照藻菌初始比例10:1、40:1、70:1、100:1和300:1的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11缺氮培养基定容至200mL；(3)最后将藻细胞放入光照培养箱进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx，通过CO2气瓶及空气压缩机以0.05L/min和0.95L/min的速度通入CO2和空气，以纯小球藻的缺氮培养体系作为对照。本专利技术方法具有如下优点：本专利技术在缺氮培养条件下将小球藻与一种固氮菌按照一定比例进行共培养，在实现氮元素限制性供给的前提下，利用固氮菌对共培养体系中营养物质的调控及氮元素的固定特性，使得小球藻既可以正常生长，又可以实现藻细胞的高效产油，从而解决了微藻“缺氮产油”及“生长需氮”之间的矛盾。附图说明图1是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻生物量和比生长速率的变化；图2是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻总脂含量及产率的变化；图3是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻中性脂含量及产率的变化；图4是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后小球藻脂肪酸比例的变化；图5是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后胞外多聚物中蛋白质浓度的变化；图6是纯藻培养和藻菌共培养体系培养10d后胞外多聚物中多糖浓度的变化；具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例一、小球藻的培养A、小球藻的选取：藻种购于中国科学院淡水藻种库(FACHB)；B、小球藻的纯化：无菌小球藻经含有抗生素的BG11平板(配方如表1所示)筛选获得。先将50μL小球藻藻液均匀涂布至含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11固体平板上，平板放入光照培养箱中培养，培养7d后挑取小球藻单藻落，划线至新鲜的含有抗生素的BG11平板上，重复三次并通过显微镜鉴定以获得无菌小球藻；C、小球藻的培养：采用BG11液体培养基进行培养，培养温度25±1℃，光照周期14h：10h，光照强度9600lx。表1BG11培养基配方(说明：培养基总体积为1000mL，固体培养基添加1.5％的琼脂)二、固氮菌的培养A、固氮菌的选取：中慢生根瘤菌B2.3(Mesorhizobiumsp.)由中国石油大学(华东)生物工程与技术中心分离保存；B、固氮菌的培养：菌株培养所用GYM培养基组成如下：葡萄糖，4g/L；酵母粉：4g/L；麦芽糖：10g/L，pH值为7.0。培养基121℃高温高压灭菌20min使用，菌株在摇床中培养，培养条件：30℃，200rpm。三、构建小球藻与菌株的共培养体系将小球藻培养至对数生长期，8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀加入适量BG11缺氮培养基进行悬浮以去除培养基中的氮源且将OD750调至为1。取40mL小球藻藻液接种到500mL锥形瓶中，同时将培养至对数期的菌株(OD600调至为1)分别按照藻菌初始比例10:1、40:1、70:1、100:1和300:1的体积比例接种至已有小球藻的培养基中，用BG11缺氮培养基定容至200mL。以纯小球藻的缺氮培养体系作为对照，在光照培养箱中进行培养。四、结果分析A、藻菌初始接种比例对小球藻生物量积累的影响通过测量纯藻培养和藻菌共培养体系中叶绿素的含量来表征小球藻生物量的变化。小球藻叶绿素含量采用96％甲醇提取法进行测定，步骤如下：取适量藻液8000×g离心15min去掉上清，藻细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次后加入10mL96％甲醇，涡旋混匀3min后超声浸提40min，期间避光加冰防止叶绿素受热见光分解。待藻体颜色变白离心取上清液，测OD653。微藻的生物量和Chla浓度根据以下公式进行计算：Microalgaedrybiomass(g/L)＝1.249×OD653,R2＝0.998；小球藻的比生长速率(μ)根据以下公式进行计算：μ＝(lnNf–lnNi)/tf–ti，其中N是最终(f)或初始(i)时间(t)的干细胞重量(g/L)。按照上述步骤得到的图1结果表明：培养10d后，小球藻与B2.3-70:1共培养体系中藻细胞的生物量积累最高，最大生物量浓度为1.68g/L，较纯藻培养体系的1.01g/L提高了66.3％；初始接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，将小球藻与固氮菌按照体积比10:1～300:1的比例在BG11缺氮培养基中共培养，从而实现藻细胞的正常生长和高效产油。

【技术特征摘要】
1.一种藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，将小球藻与固氮菌按照体积比10:1～300:1的比例在BG11缺氮培养基中共培养，从而实现藻细胞的正常生长和高效产油。2.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述小球藻经含有100mg/L氨苄青霉素、50mg/L壮观霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的BG11平板筛选获得。3.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述固氮菌为中慢生根瘤菌B2.3。4.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述小球藻的初始OD750＝1，固氮菌的初始OD600＝1。5.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述小球藻与固氮菌的最优藻菌体积比为70︰1。6.根据权利要求1所述的藻菌共培养促进小球藻生长和油脂积累的方法，其特征在于，所述藻菌共培...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛保胜，卫治金，王皓楠，刘恒恒，郗丽君，黄方，邹建昊，徐家乐，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37