抗寨卡病毒药物筛选模型及筛选方法技术

本发明专利技术提供一种抗寨卡病毒药物筛选模型及筛选方法。所述药物筛选模型为感染了寨卡病毒且具有活性的Vero细胞。利用本发明专利技术提供的抗寨卡病毒药物筛选模型可以快速、有效、高通量筛选待测药物的抗病毒活性，为筛选出安全可靠且有效的抗寨卡病毒药物提供了切实可行的方法。

【技术实现步骤摘要】
抗寨卡病毒药物筛选模型及筛选方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，涉及一种抗寨卡病毒药物筛选模型及筛选方法。
技术介绍
寨卡病毒(ZikaVirus)属于蚊媒传播的黄病毒属病毒，基因组为单股正链RNA，全长约11kb，编码一个开放读码框(Openreadingframe,ORF)，可形成一个多聚蛋白。寨卡病毒最早于1947年在乌干达恒河猴体内分离得到。1952年首次记录了人类感染寨卡病毒的病例。2007年在太平洋雅普岛出现了寨卡病毒疫情的爆发。2016年世界卫生组织(WHO)公布的数据显示，73个国家或地区发生了寨卡病毒感染。截止2016年11月1日，我国共报道24例寨卡病毒输入性病例。人感染寨卡病毒后，主要临床表现为皮疹、发热、肌肉酸痛、非化脓性结膜炎、头痛等。此外，巴西寨卡疫情爆发后，越来越多的证据显示出寨卡病毒感染与新生儿小头畸形存在密切关联。由于寨卡病毒疫情严峻，并且没有特异针对寨卡病毒感染的治疗药物及疫苗，因此亟待研发抗寨卡病毒新药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗寨卡病毒药物筛选模型。本专利技术的另一目的是提供一种抗寨卡病毒药物的筛选方法。本专利技术构思如下：病毒感染宿主细胞后在胞内大量增殖，可导致细胞变圆和脱落，此现象被称为细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)。寨卡病毒在其易感细胞VeroE6内扩增到一定程度将会导致细胞出现CPE，细胞死亡，活细胞减少。通过测定寨卡病毒感染细胞的细胞活力，可以间接反应出细胞内病毒的增殖水平和感染性。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供抗寨卡病毒药物筛选模型，所述药物筛选模型为感染了寨卡病毒且具有活性的Vero细胞，优选VeroE6细胞。优选地，寨卡病毒按MOI≥1感染细胞。将Vero细胞接种于含有10％FBS的DEME培养液中，于37℃，5％CO2培养箱静置培养2-3天即可长成致密单层细胞，待细胞汇合度达70％左右，感染寨卡病毒。本专利技术中，Vero细胞以及感染了寨卡病毒的细胞于含有10％FBS的DMEM培养液中培养。第二方面，本专利技术提供所述药物筛选模型在筛选寨卡病毒抑制剂或抗寨卡病毒药物中的应用。第三方面，本专利技术提供利用所述药物筛选模型筛选抗寨卡病毒药物的方法，寨卡病毒感染Vero细胞后，向细胞培养液中加入待测的候选药物，培养一段时间后，测定细胞的活性，根据细胞活性筛选出具有抗寨卡病毒活性的药物。进一步地，本专利技术抗寨卡病毒药物的筛选方法为：寨卡病毒感染Vero细胞后，向细胞培养液中加入待测的候选药物作为实验组，同时以只感染寨卡病毒的Vero细胞作为对照组，未感染寨卡病毒的Vero细胞作为无感染对照组，培养一段时间后，分别测定各组的细胞活性，按照式(I)计算出病毒抑制率，筛选得到具有抗寨卡病毒活性的药物。评价样品抗病毒活性的方法包括：1、SD法当测试样品数量较大时，按如下公式计算样品SD与样品均值SD的离散程度，评价样品的抗病毒效果。(OD样品–OD平均值)/SD(OD平均值)2)抑制率法：病毒抑制率(％)＝[1–(OD实验组–OD无感染对照组)/(OD对照组–OD无感染对照组)]×100％式(I)其中，式(I)中的OD值为450nm处的吸光值。该方法是通过测定寨卡病毒感染后细胞活性，间接反应细胞内病毒复制水平，通过450nm处吸光值OD大小来确定细胞活性，以此判断样品是否具有抗病毒活性，从而筛选出抗寨卡病毒药物。优选地，感染了寨卡病毒的细胞于37℃，5％CO2条件下静置培养48-96h(优选96h)后测定细胞的活性。本专利技术中，优选采用CCK-8法(细胞毒性/增殖检测试剂盒CCK-8)测定细胞活性，Vero细胞与CCK-8检测试剂(如WST-8)于37℃，5％CO2条件下孵育1.5h测定细胞的活性。第四方面，本专利技术提供按照上述方法筛选得到的抗寨卡病毒药物。本专利技术通过CCK-8法对寨卡病毒感染后的细胞活性进行检测，建立了一套简便、灵敏、稳定的定量分析寨卡病毒的感染性的方法，进而验证其作为寨卡病毒抑制剂高通量筛选体系的可行性。通过对32000个微生物发酵液样品进行试验性的筛选，对筛选模型进行评价，结果证明了该模型适用于抗寨卡病毒化合物的大规模筛选。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：利用本专利技术提供的抗寨卡病毒药物筛选模型可以快速、有效、高通量筛选待测药物的抗病毒活性，为筛选出安全可靠且有效的抗寨卡病毒药物提供了切实可行的方法。附图说明图1为本专利技术实施例2中寨卡病毒分别以感染复数MOI2、1和0.5感染VeroE6细胞，感染后24、48、72和96h检测细胞活性，结果显示当感染复数MOI等于1及以上，感染后96h的病毒感染组细胞活性显著降低。图2为本专利技术实施例2中细胞活性测定时，对WST-8试剂孵育时间进行优化的结果。图3为本专利技术实施例3中利巴韦林的量效关系曲线。图4为本专利技术实施例3中筛选模型Z’因子的确定。图5为本专利技术实施例4中利用药物筛选模型对32000个微生物发酵液进行初步筛选的结果。其中，A：32000个样品筛选结果，纵坐标为计算得到的样品相对SD水平用于评价抗寨卡病毒的能力。绘制软件为GraphPad。B：以MOI＝1感染VeroE6细胞，加入阳性发酵液(发酵液1221B-1A)10μl，感染后48h收集细胞，检测胞内寨卡病毒RNA及蛋白水平。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的细胞培养液为含有10％FBS的DMEM培养基。实施例1抗寨卡病毒药物筛选模型的构建及筛选药物的方法1、VeroE6细胞培养取VeroE6细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基。向培养瓶中加入适量的0.25％胰酶消化细胞(消化时每个T25培养瓶加入0.25％胰酶1.5mL左右)在室温下放置1分钟左右，待显微镜下观察到细胞变圆，弃消化液，立即加入培养基，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，取细胞悬液接种于96孔板，5000个细胞/孔。2、样品活性检测以微生物发酵液为筛选目标，寨卡病毒(MOI＝1)感染细胞后，直接加入待筛选的微生物发酵液1μl/孔，作为实验组；加入1μlDMEM培养基为VeroE6细胞无感染对照组(未感染病毒)；只感染寨卡病毒孔为病毒对照组；感染病毒孔加入利巴韦林80μM作为阳性对照。各组细胞在37℃，5％CO2条件下培养一段时间后，利用试剂盒CCK-8(WST-8检测试剂)分别测定各组的细胞活性，间接反应细胞内病毒复制水平，通过450nm处吸光值OD大小来确定细胞活性，以此判断待测样品是否具有抗病毒活性，从而筛选出抗寨卡病毒药物。3、检测结果的分析按照式(I)计算出病毒抑制率：病毒抑制率(％)＝[1–(OD实验组–OD无感染对照组)/(OD对照组–OD无感染对照组)]×100％式(I)实施例2模型的优化方法在模型构建过程中，专利技术人对多个参数进行了优化，具体优化了感染复数、病毒活性的检测时间及CCK-8孵育时长。具体如下：考察了病毒感染剂量和感染时间对分析结果的影响。寨卡病毒分别以感染复数MOI2、1和0.5感染VeroE6细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗寨卡病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为感染了寨卡病毒且具有活性的Vero细胞。

【技术特征摘要】
1.抗寨卡病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为感染了寨卡病毒且具有活性的Vero细胞。2.根据权利要求1所述的药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为感染了寨卡病毒且具有活性的VeroE6细胞。3.根据权利要求1或2所述的药物筛选模型，其特征在于，寨卡病毒按MOI≥1感染细胞。4.根据权利要求3所述的药物筛选模型，其特征在于，感染了寨卡病毒的细胞于含有10％FBS的DMEM培养液中培养。5.权利要求1-4任一项所述药物筛选模型在筛选寨卡病毒抑制剂或抗寨卡病毒药物中的应用。6.利用权利要求1-4任一项所述药物筛选模型筛选抗寨卡病毒药物的方法，其特征在于，寨卡病毒感染Vero细胞后，向细胞培养液中加入待测的候选药物，培养一段时间后，测定细胞的活性，根据细胞活性筛选出具有抗寨卡病毒活性的药物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，寨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓宇，周睿，田东芳，张永欣，岑山，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11