一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用，该大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株于2018年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018403；其分类命名为大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），拉丁文学名Escherichia coli Nissle（Tum 5‑p53）。本发明专利技术构建的大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），含有抗肿瘤低氧表达载体pET28a‑Pvhb‑SUMO‑Tum 5‑MMP‑p53，能高效表达双功能蛋白Tum 5‑p53，能将抗血管生成因子Tum‑5和肿瘤抑制蛋白p53传递至实体瘤，发挥良好的抗肿瘤疗效。该株抗肿瘤靶向工程菌对荷人肝癌SMMC‑7721裸鼠的肿瘤抑制率高达69.47%。
【技术实现步骤摘要】
一株大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一株抗肿瘤靶向工程菌，具体涉及一株大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
癌症严重威胁人类生命健康。传统的癌症治疗方法，如手术治疗、放疗和化疗，通常不能完全消除肿瘤厌氧微环境中的肿瘤细胞。利用靶向传递载体将抗癌基因或抗肿瘤药物递送到肿瘤低氧区域进行癌症治疗，是近年来迅速发展的一种最具有临床应用前景的癌症治疗方法。E.coliNissle1917(EcN)最初由军人外科医生AlfredNissle从一名士兵的粪便中分离出来，该士兵在严重的志贺氏菌病爆发期间没有出现腹泻。近年来，肠道益生菌EcN已被制备成药物用来治疗腹泻和溃疡性结肠炎疾病(BiochemistryBiokhimiia.2010；75(4):481-485)。Zhang等利用EcN用作基因治疗的传递载体，将EcN静脉注射荷瘤小鼠，解剖小鼠获得肺、肝、脾、肾、心脏和肿瘤组织后研磨涂平板，发现EcN能特异性地靶向肿瘤区域(AppliedandEnvironmentalMicrobiology.2012；78(21):7603-7610)。Jochen等以静脉注射、腹腔注射和瘤内注射三种不同的注射方式，将EcN注射荷瘤小鼠以研究其靶向性，研究结果显示，无论以哪种注射方式，EcN都能在肿瘤区域定殖和生长，而在其它内脏器官中未发现细菌的存在(InternationalJournalofMedicalMicrobiologyIjmm.2007；297(3):151-162)。鉴于EcN高度的肿瘤靶向特性，及其在脾脏和肝脏组织能及时被机体有效清除，所以选择EcN作为靶向传递抗肿瘤蛋白的载体，传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区，在未来癌症治疗中将是一个有前景的肿瘤治疗途径。CN107574138A公开了一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用，其所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即EscherichiacoliNissle1917(Tum-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017345。该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum5，能可溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum-5；该株抗肿瘤靶向工程菌对荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠的肿瘤抑制率为52.95％。目前，大肠杆菌EcN虽然对实体瘤具有高度靶向性，能在肿瘤低氧区域特异性定殖，可作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区域；但真核抗肿瘤蛋白在原核细菌中表达时存在困难：蛋白可溶性表达情况欠佳、容易形成包涵体蛋白、难以获得具有正常空间结构的活性蛋白；另外，由于肿瘤细胞发展的抗药性可能使药物再次使用时治疗效果差；单一基因治疗肿瘤时也存在疗效持续性差等缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株肿瘤靶向性较高、经济性较好和安全性高的大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌。本专利技术进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌的构建方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案如下：一株大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌于2018年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M2018403。该大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌株分类命名为大肠杆菌EcN（Tum5-p53）；拉丁文学名EscherichiacoliEcN（Tum5-p53）。进一步，所述EcN(Tum5-p53)含有抗肿瘤低氧表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum5-MMP-p53，高效表达双功能蛋白Tum5-p53同时能特异性地靶向肿瘤低氧区域，将抗血管生成因子Tum-5和肿瘤抑制蛋白p53传递至实体瘤。本专利技术进一步解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌的构建方法，包括以下步骤：(一)利用重叠PCR构建Tum5-p53融合表达载体；(二)Tum5-p53融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；(三)Tum5-p53融合蛋白的体外抗肿瘤活性检测；(四)EcN(Tum5-p53)的构建；(五)EcN(Tum5-p53)在荷瘤裸鼠体内的定殖情况分析；(六)EcN(Tum5-p53)的抗肿瘤分析；(七)EcN(Tum5-p53)的安全性检测。进一步，步骤(一)中，所述Tum5-p53融合表达载体是以基质金属蛋白酶(MMP)酶切位点(PLGLWA)为融合基因连接臂，利用PCR扩增出带连接臂的Tum-5片段和带连接臂的p53片段，再利用重叠PCR获得Tum5-MMP-p53片段。进一步，步骤(四)中，所述EcN(Tum5-p53)的构建是将低氧启动子Pvhb、SUMO促溶标签、抗血管生成因子Tum-5和抗癌蛋白p53四段基因序列，以基质金属蛋白酶(MMP)酶切位点(PLGLWA)为融合基因连接臂，通过重叠PCR技术获得包含四段基因序列的PCR产物，再利用酶切连接的方法将包含四段基因序列的PCR产物连接到载体pET-28a，通过电击转化EscherichiacoliNissle1917，即得到大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EscherichiacoliNissle1917(Tum5-p53)。本专利技术还包括大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌在制备用于治疗肝癌和宫颈癌的靶向抗肿瘤药物中的应用。进一步，所述肝癌和宫颈癌肿瘤细胞系为肝癌SMMC-7721细胞和人宫颈癌HeLa细胞。本专利技术是采用联合基因治疗手段，构建能诱导细胞凋亡和抑制肿瘤区域血管生成的双功能蛋白，同时，该蛋白在肿瘤靶向菌中能够高效表达。利用重叠PCR拼接获得了四个Tum5和p53融合表达的载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。蛋白可溶性分析结果表明，当Tum-5蛋白位于融合蛋白的N端，且在SUMO标签存在的情况下，以部分可溶的形式存在。将本专利技术的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum5-p53)发酵后菌体蛋白和溶解蛋白进行SDS-PAGE检测和Westernblot检测，结果表明，Tum5-p53双功能蛋白已成功在EcN中实现高效表达；将野生型EcN注射于荷人肝癌SMMC-7721裸鼠后，活体成像系统观察到EcN能特异性地在实体瘤区域定殖，其它器官中的细菌能及时被动物机体清除；免疫组化结果表明，Tum5-p53蛋白成功在实体瘤中表达；用本专利技术方法构建的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum5-p53)治疗荷人肝癌裸鼠，结果表明，该抗肿瘤靶向工程菌能显著地抑制肿瘤的生长，对BALB/c荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率高达69.47％，且对正常小鼠基本无毒性作用。概而言之，本专利技术具有以下有益效果：(1)抗肿瘤效果：大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum5-p53)对人肝癌SMMC-7721肿瘤有明显的抗肿瘤作用，实验证明EcN(Tum5-p53)对肿瘤体积和重量的抑制率分别达到69.47％和62.5％；(2)没有任何毒副作用：荷瘤小鼠注射大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum5-p53本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株为Escherichia coli Nissle 1917（Tum 5‑p53），缩写为EcN（Tum 5‑p53），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2018403。
【技术特征摘要】
1.一株大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株为EscherichiacoliNissle1917（Tum5-p53），缩写为EcN（Tum5-p53），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M2018403。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，其特征在于，所述EcN（Tum5-p53）含有抗肿瘤低氧表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum5-MMP-p53，高效表达双功能蛋白Tum5-p53同时能特异性地靶向肿瘤低氧区域，将抗血管生成因子Tum5和肿瘤抑制蛋白p53传递至实体瘤。3.一种如权利要求1或2所述的大肠杆菌Nissle1917抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）利用重叠PCR构建Tum5-p53融合表达载体；（二）Tum5-p53融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；（三）Tum5-p53融合蛋白的体外抗肿瘤活性检测；（四）EcN（Tum5-p53）的构建；（五）EcN（Tum5-p53）在荷瘤裸鼠体内的定殖情况分析；（六）EcN（Tum5-p53）的抗肿瘤分析；（七）EcN（Tum5-p53）的安全性检测。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：夏立秋，何恋，丁学知，孙运军，胡胜标，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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