一株假单胞菌及其在石油降解中的应用制造技术

本发明专利技术公开一株假单胞菌Pseudomonadaceae sp.GR5，已于2018年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址，中国，武汉，武汉大学，保藏号CCTCC M 2018488。以库尔勒塔中油田污染土壤中筛选得到，菌株GR5呈球杆状，革兰氏结果呈阴性，经16sRNA鉴定为假单胞菌。经过人工驯化将该菌种驯化到原油浓度高达60g/L时依然能够正常生长繁殖。本发明专利技术的石油降解菌在最适温度30℃，最佳PH7.0的条件下降解20天，对含原油20g/L的液体培养基中原油降解率达到84.4%，原油降解率极高，具有很大的应用前景。可以应用于微生物修复去除土壤和水体环境中的原油污染等领域。

【技术实现步骤摘要】
一株假单胞菌及其在石油降解中的应用
本专利技术涉及一种假单胞菌GR5及其在石油降解中的应用。
技术介绍
在原油的开采、炼制、运输和使用过程中，不可避免的会发生石油的泄露，进入环境造成污染。对河流、土壤、地下水以及海洋等环境造成严重污染。在陆地，原油污染一般由开采钻屑油泥、输油管道破裂等造成；在海洋中，油井溢油、油船泄露造成。据统计全世界平均每年有600-1000万吨原油通过各种途径进入环境。之后通过物理化学作用方式向周围扩散至更大范围。原油的化学组成复杂，包括烷烃、环烷烃、芳香烃、沥青质等多种物质有毒物质。其中一些多环芳烃具有致癌、致畸、致突变作用，其可以通过食物链最终进入人体，危害人类健康。目前，石油污染的去除方法主要有三种：物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是焚烧法、隔离法和换土法，成本高，不能将污染物完全去除。化学方法主要是萃取法、洗涤法和化学氧化法，污染物去除不彻底，容易引起二次污染。生物方法是指利用生物的生命代谢活动降解石油污染物（主要是微生物），其处理效果好、成本低、对环境影响较小，具有较好的应用前景。虽然,生物法治理石油污染环境已经有了大量的研究，但是，目前，应用于石油污染处理的降解菌生长速率缓慢、降解率低，降解速率缓慢，不能达到理想的降解效果。为了取得高效、彻底的生物修复效果，分离和筛选石油污染物的高效降解菌的生物修复的必然要求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是在于提供一株降解石油烃的菌株GR5(假单胞菌Pseudomonassp.GR5),已于2018年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址，中国，武汉，武汉大学，保藏编号CCTCCN0:M2018488。本专利技术的目的在于提供上述石油降解菌GR5的应用。所述应用具体为将Pseudomonadaceaesp.GR5菌液直接投加到石油污染的水体或者土壤中；或将Pseudomonadaceaesp.GR5固定到载体上制备成菌剂，再将菌剂施用到石油污染的水体或者土壤中。本专利技术的另一个目的是提供一种降解石油烃的固体菌剂，所述固体菌剂的活性成分包括菌株GR5，保藏号CCTCCM2018488。所述固体菌剂为将Pseudomonadaceaesp.GR5固定到载体上制备成的菌剂。进一步地，所述载体为玉米秸秆，粉碎粒径≤200微米的无菌秸秆。进一步地，所述载体的处理方法为高压蒸汽灭菌处理，将灭菌后的秸秆于40-50℃烘干至恒重，粉碎机粉碎过40目筛，在蒸馏水中浸泡2h，调节pH7-8，至于40-50℃烘干至恒重。进一步地所述菌剂中Pseudomonadaceaesp.GR5有效活菌数与秸秆比例为0.5ｘ109-2ｘ109个/克。进一步地所述菌剂制备方法为将Pseudomonadaceaesp.GR5菌液与秸秆直接混合均匀，得到混合菌剂。进一步地，为减少菌剂的水分，以利于储存和运输，将其制成冻干菌剂，制备方法如下：将Pseudomonadaceaesp.GR5菌液中加入150-300g/L甘油混匀，再与秸秆直接混合均匀，置于真空冷冻干燥仪中进行干燥处理，得到冻干菌剂。进一步地，所述真空冷冻干燥的参数为-44℃预冷2h，升温至-34℃升华10h，继续升温到31℃，即得到冻干菌剂。进一步地，应用于石油降解菌Pseudomonadaceaesp.GR5菌液处于对数生长期或稳定期，其密度为1ｘ1010-2ｘ1010个/ml。进一步地，所述Pseudomonadaceaesp.GR5的培养采用LB液体培养基，配方为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。进一步的，所述Pseudomonadaceaesp.GR5的培养条件为温度30℃，pH7.0，培养时间60h，转速150rpm。进一步地，所述菌剂用于石油污染土壤修复的使用方式为：保持土壤30%-35%的含水量，按照每立方米土壤3kg菌剂的用量进行菌剂的播种，对土壤进行翻耕，使之与菌剂充分混合。相比于现有技术，本专利技术有以下优势：（1）本专利技术提供的Pseudomonadaceaesp.GR5菌株能以原油为唯一碳源生长，因此可以用于石油污染的降解修复，特别是水体、土壤中石油污染物的降解；其培养方法简单、生长周期短、生物量大，耐受石油烃浓度高、应用范围广；在LB培养基中培养48hOD600吸收值可达6.0以上，可在短时间内获得高浓度菌体。（2）本专利技术采用玉米秸秆作为固定化载体材料制备成菌剂，玉米秸秆为农业废弃物，价格低，易得，含有丰富的营养，易降解不会引入二次污染，一方面为农业废弃物提供资源化利用的出路，另一方面玉米秸秆改善土壤环境，通风透气，为微生物生长提供更多氧气。本专利技术菌剂所用固定化方法为吸附法，仅需将菌液和秸秆混合均匀即可，制备工艺简单，生产费用低，处理效果好。本专利技术公开一株假单胞菌Pseudomonadaceaesp.GR5以库尔勒塔中油田污染土壤中筛选得到，菌株GR5呈球杆状，革兰氏结果呈阴性，经16sRNA鉴定为假单胞菌。经过人工驯化将该菌种驯化到原油浓度高达60g/L时依然能够正常生长繁殖，耐油性强，在pH6-8的范围均可生长良好。本专利技术的石油降解菌在最适温度30℃，最佳PH7.0的条件下,在降解反应20天后，对含原油20g/L的液体培养基中原油降解率达到84.4%，原油降解率极高，具有很大的应用前景。本专利技术菌剂对低浓度（小于2%）石油污染土壤有明显的修复效果，可用于大面积石油污染土壤的生物修复。附图说明图1为实验例中的菌株在不同pH条件下原油无机盐液体培养基中的生长量。图2为实验例中不同pH条件下原油无机盐液体培养基中的生长量。图3为菌种在最适pH温度条件下，对原油无机盐培养基的原油降解率。具体实施方式以下结合具体实施例来对本专利技术做进一步说明。以下是实施例中所用的培养基配方：富集培养基：KH2PO41.0g，（NH4）2SO41.0g，MgSO40.5g，CaCl2·2H2O0.04g，FeSO4·7H2O0.01g，Na2HPO40.5g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，蒸馏水1000ml（培养基pH根据原土样的pH调节）。无机盐培养基（实验时以石油为唯一碳源）：KH2PO41.0g，（NH4）2SO41.0g，MgSO40.5g，CaCl2·2H2O0.04g，FeSO4·7H2O0.001g，蒸馏水1000ml（培养基pH根据原土样的pH调节，纯化需固体培养基时可加琼脂糖15g）。LB培养基：蛋白胨10g，NaCl10g，酵母提取物5g，蒸馏水1000ml（培养基pH根据原土样的pH调节，需固体培养基时可加琼脂20g）。原油培养基：无机盐培养基中加入浓度2%的原油。筛选培养基：无机盐培养基中加入0.5%柴油，再加入2%的琼脂。以上培养基使用前均在0.1MPa、121℃灭菌20min。实施例1Pseudomonadaceaesp.GR5菌株的获得石油降解菌的筛选、分离及纯化（1）菌株来源：石油降解菌从大庆格瑞油田污染的土壤中分离获得。（2）菌株的驯化富集a.取10g石油污染的油泥样品，加入到含有0.4%原油的无机盐培养基中，30℃恒温摇床培养5d，转速150rpm。b.从上一步培养液中取5ml上清，转接到含有0.6%原油无机盐培养基中，150rpm,30℃恒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假单胞菌GR5，保藏号为CCTCC M 2018488。

【技术特征摘要】
1.一种假单胞菌GR5，保藏号为CCTCCM2018488。2.权利要求1所述的假单胞菌GR5在降解石油中的应用。3.根据权利要求2所述的假单胞菌GR5的应用，其特征在于：所述应用具体为将假单胞菌菌液直接投加到石油污染的水体或土壤中；或将假单胞菌固定到载体上制备成菌剂，再将菌剂施用到石油污染的水体或土壤中。4.权利要求1所述的假单胞菌GR5在生物修复原油污染土壤中的应用。5.权利要求1所述的假单胞菌GR5在生物修复原油污染的水体中的应用。6.一种降解石油烃的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为假单胞菌GR5，保藏号CCTCCM2018488。7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为将假单胞菌GR5固定到载体上制备成的固体菌剂。8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于：所述载体为玉米秸秆，粉碎粒径≤200微米的无菌秸秆。9.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于：所述载体的处理方法为高压蒸汽灭菌处理，将灭菌后的秸秆于40-50℃烘干至恒重，粉碎机粉碎过40目筛，在蒸馏水中浸泡2h，调节pH7-8，至于40-50℃烘干至恒重。10.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于：菌剂中假单胞菌GR5有效活菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴柏平，张晓林，
申请(专利权)人：杭州造品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33