鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法。该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该核酸分子引物AFu‑18F：5’‑CTATCTATTAAACTTTCCATG‑3’和AFu‑18R：5’‑TTACTATATCTGAGTCAGCAC‑3’。利用本发明专利技术的核酸分子引物AFu‑18F和AFu‑18R进行PCR扩增，仅灰花纹鹅膏能够扩增获得该特征性核苷酸序列，而其他样品没有扩增到任何片段，这表明本发明专利技术的核酸分子引物AFu‑18F和AFu‑18R具有很好的专一性，可以用于快速的鉴别灰花纹鹅膏(子实体)。

【技术实现步骤摘要】
鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法
：本专利技术属于利用分子生物学方法鉴别毒蘑菇的
，具体涉及鉴别灰花纹鹅膏(AmanitafuligineaHongo)的特征性核苷酸序列、核酸分子引物和方法。
技术介绍
：鹅膏属(Amanita)隶属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、鹅膏科(Amanitaceae)。鹅膏属是世界性分布的大属，目前已报道种类超过了500种(杨祝良，2015)，其中含有不少使人致命的剧毒种类。据统计，90％以上的蘑菇中毒死亡事件都是由误食剧毒鹅膏引起的，目前我国已报道13种剧毒鹅膏(Caietal,2016)，其中灰花纹鹅膏是我国蘑菇中毒死亡的主要“杀手”，由此毒菌引起的中毒死亡人数占我国剧毒鹅膏中毒死亡总数的79％(Cuietal.,2018)。因此，建立快速、准确的鉴别方法，对于有效抢救误食灰花纹鹅膏中毒患者具有重要意义。随着分子生物学技术的快速发展，基于核酸的快速检测技术已被广泛应用，如采用RAPD、RFLP和RT-PCR等技术对病原菌的检测。已有研究表明，剧毒鹅膏菌含有丰富的鹅膏毒肽及其相关环肽物质，这些环肽是由MSDIN基因家族编码而成(Hallenetal.,2007)。剧毒鹅膏中存在丰富多样的MSDIN基因家族成员，而且不同的剧毒鹅膏菌均有许多特异的肽类编码基因(贺勇等，2018)。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供来源于灰花纹鹅膏(AmanitafuligineaHongo)基因组DNA中特有环肽基因，用于鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供以灰花纹鹅膏基因组DNA中特有环肽基因为基础，设计用于鉴别灰花纹鹅膏的核酸分子引物，该核酸分子引物序列如下：AFu-18F：5’-CTATCTATTAAACTTTCCATG-3’(如SEQIDNO.2所示)；AFu-18R：5’-TTACTATATCTGAGTCAGCAC-3’(如SEQIDNO.3所示)。上述核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R，具有很好的特异性，能专一地扩增灰花纹鹅膏菌的特有基因。利用该引物通过PCR扩增可以快速的对灰花纹鹅膏(子实体)进行鉴别。本专利技术的第三个目的是提供一种灰花纹鹅膏快速鉴定试剂盒，包括上述核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R，以及常规的DNA提取试剂和常规的PCR反应试剂。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴别灰花纹鹅膏的方法，采用上述的核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R作为PCR引物，以待测样品基因组DNA为模板，利用PCR方法鉴定待测样品是否为灰花纹鹅膏。具体是采用上述核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R作为特异性扩增引物，以待测样品基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，可以直接获得清晰的灰花纹鹅膏特异性条带(大小为428bp)，无需测序步骤，实现对灰花纹鹅膏的鉴别。本专利技术基于鉴别灰花纹鹅膏特有的环肽基因，设计特异性的核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R，并以该核酸分子引物为引物，以灰花纹鹅膏的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段(灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示)，经测序其具体序列长度为428bp(如图1)。利用本专利技术的核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R进行PCR扩增，仅灰花纹鹅膏能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段(如图2)，这表明本专利技术的核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R具有很好的专一性，可以用于快速的鉴别灰花纹鹅膏(子实体)。本专利技术首次基于本专利技术人获得的灰花纹鹅膏基因组数据，分析其肽类基因家族成员，并发现了其特有的肽类编码基因。本专利技术根据灰花纹鹅膏特有氨基酸序列MSDINATRLPHLFTWIPPCISDDSTLTRGER及其核心氨基酸序列HLFTWIPP设计特异性引物。因此，本专利技术人针对灰花纹鹅膏特有的肽类编码基因，设计特异性引物，优化PCR体系与条件，建立灰花纹鹅膏菌的快速检测技术，整个检测过程仅需4～6小时(包含DNA提取步骤)。本专利技术采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好，用时短，4～6h即可完成。附图说明：图1是本专利技术所述的鉴别灰花纹鹅膏的特征性核苷酸序列；图2是利用本专利技术的核酸分子引物AFu-18F和AFu-18R作为引物按照常规的PCR方法对不同鹅膏样品进行PCR的产物的电泳图，其中1、灰花纹鹅膏，2、致命鹅膏、3、裂皮鹅膏、4、拟灰花纹鹅膏，5、中华鹅膏(外型与灰花纹鹅膏近似，可食用)，M为2Kb的DNA分子量标准。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：灰花纹鹅膏及其近似种基因组DNA的提取取灰花纹鹅膏、致命鹅膏、裂皮鹅膏、拟灰花纹鹅膏和中华鹅膏样品各20mg置于无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，加入2％(w/v)CTAB抽提缓冲液700μL，继续研磨几秒后倒入1.5mL微量离心管中，65℃水浴保温1h。向1.5mL含有样品的微量离心管中加入蛋白酶K，颠倒混匀2min，10000rpm离心15min，用200μL移液器将上清液转入新的离心管中，弃沉淀。上清液中加入5μLRNAase，室温静置15min，加入与之等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀8-10次，12000rpm离心10min，用200μL的微量移液器将含有DNA的上层(水相)小心地移入一只新管中，加入与DNA溶液(含盐溶液)0.75倍的异丙醇(-4℃预冷)轻轻混匀，于-4℃静置2h。12000rpm离心10min，弃上清液，用体积分数75％乙醇水溶液洗涤沉淀物两次。室温下自然晾干。自然干燥后加入50μL无菌的超纯水溶解DNA。实施例2：灰花纹鹅膏及其近似种特异性引物的PCR扩增根据灰花纹鹅膏的特有环肽编码基因序列设计特异性引物AFu-18F(5’-CTATCTATTAAACTTTCCATG-3’)和AFu-18R(5’-TTACTATATCTGAGTCAGCAC-3’)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以基因组DNA为模板，反应体系为25μL总体积：TksGflexDNAPolymerase0.8μL，TksGflexBuffer12μL，引物AFu-18F和AFu-18R各1μL，模板DNA1μL，补无菌水至25μL。反应程序为94℃预热1min，98℃变性20sec，65℃退火20sec，68℃延伸25sec，8个循环；98℃变性20sec，58℃退火20sec，68℃延伸25sec，18个循环；94℃变性20sec，52℃退火20sec，68℃延伸30sec，18个循环；68℃5min，10℃保温。电泳检测PCR结果，电泳图如图2所示，从图2可以看出，仅灰花纹鹅膏能够扩增出特异性片段，而致命鹅膏、裂皮鹅膏、拟灰花纹鹅膏、中华鹅膏没有扩增出任何片段，这表明本专利技术的核酸分子引物具有极高的专一性，特异性好，因此可以用于快速的鉴别灰花纹鹅膏。将灰花纹鹅膏的特异性片段送去测序，片段长度为428bp(如S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea Hongo)的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别灰花纹鹅膏(AmanitafuligineaHongo)的特征性核苷酸序列，其特征在于，该特征性核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于鉴别灰花纹鹅膏(AmanitafuligineaHongo)的核酸分子引物，其特征在于，该核酸分子引物包括：AFu-18F：5’-CTATCTATTAAACTTTCCATG-3’；AFu-18R：5’-TTACTATATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓旺秋，贺勇，李挺，李泰辉，张成花，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44