准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法技术

本发明专利技术提供了准确鉴别插入突变纯、杂合型线虫的三引物组及PCR鉴别方法，属于基因编辑技术领域，更具体地涉及一种准确鉴别插入突变纯、杂合型线虫的三引物组及PCR鉴别方法，通过设计上游引物WT‑S、下游引物WT‑A和第三引物I‑S，并将该三引物组用于插入突变纯、杂合型线虫的PCR鉴定中，对野生型、插入突变型DNA模板，进行竞争性PCR，很好地解决了二引物组PCR导致的假阴性结果和易丢失插入突变的问题，更准确地鉴别出野生型、插入突变杂合型及插入突变纯合型线虫。类推，也可以通过设计上游引物WT‑S、下游引物WT‑A和第三引物I‑A，组成三引物组对插入突变纯、杂合型线虫进行鉴定。此鉴别方法可以广泛用于其他物种中插入型突变体的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法
本专利技术属于基因编辑
，更具体地涉及一种准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法，本专利技术也可以用于其他物种基因组中基因插入突变体的快速鉴定。
技术介绍
通过基因敲入的技术在基因组自身基因的5’端、3’端或其他位置插入调控元件、转座子、荧光标签蛋白、小蛋白标签、抗性基因等，具有非常重要的意义。该技术可以用于研究基因调控、揭示蛋白表达分布、以及在不同发育阶段蛋白位置变化、测定不同发育阶段的蛋白表达量、帮助富集某些体内蛋白、导入抗性基因表达等。随着CRISPR/Cas9基因敲入技术的运用，大片段基因敲入运用的广度和深度也增加了。但是因为基因敲入涉及到同源重组修复，对于易错的非同源末端连接修复来说，同源重组修复发生的效率特别低。因此对基因敲入突变体的准确筛选和正确鉴定非常重要，能大大减少人力物力和时间的消耗。当一个基因插入序列的长度比较大(大于50bp)，可以通过比较序列插入前后PCR扩增片段大小区分野生型、杂合突变体和纯合突变体。通常采用的是二引物组鉴别法，即在被插入序列的上下游各设一条引物组成一个引物对，以基因组DNA为模板进行特异性扩增，之后进行普通的琼脂糖凝胶电泳即可。但在实践中，杂合模板中包含了插入突变型和野生型两种模板，以插入突变型为模板需扩增片段长度长，而以野生型为模板需扩增片段长度短。在PCR聚合酶链式反应的延伸步骤中，长片段的延伸效率大大低于短片段的延伸效率，因此当利用传统二引物组扩增法鉴定杂合模板时，混合模板中的插入型模板的扩增因为扩增长度长而被抑制，扩增产物中主要为扩增野生型模板得到的短片段。此时，杂合线虫模板很容易被鉴定成野生型模板，导致假阴性情况的发生。一般插入片段长度越大，假阴性发生概率越高。请参见附图1，该图为二引物组扩增鉴定法中的两条引物在野生型模板上的结合位点示意图。图中浅灰色部分所示为在野生型基因中被插入的序列，长度为846bp的GFP插入，图中所示黑色区域为被插入序列5’端和3’端的野生型序列，在被插入序列的上游500bp和下游500bp的位置分别设置上游引物WT-S和下游引物WT-A，组成第一引物对。如图1所示，以野生型线虫为模板，PCR产物长度为1000bp，以纯合插入突变为模板，PCR产物长度为1864bp，以杂合突变线虫为模板，理论上PCR产物的长度有两种，分别为1000bp和1864bp，但是因为1864bp扩增产物被1000bp扩增产物竞争抑制，得到的PCR产物为1000bp。这样很容易将杂合插入突变体当成了野生型，杂合和纯合模板不能被很好的区分即导致了假阴性的出现。由于假阴性结果会影响插入突变纯合体的筛选，一旦出现误把杂合型当成野生型，会造成筛选效率降低，严重时候可能造成筛选“假性失败”。无形中增加了成本的预算以及时限上的延误。因此，避免杂合插入突变型线虫假阴性的出现至关重要。
技术实现思路
为此，需要提供一种能准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组及其PCR鉴别方法以解决鉴别插入突变纯、杂合线虫时出现假阴性等鉴别结果不准确和鉴别效率低下的问题。为实现上述目的，专利技术人提供了准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组，所述三引物组由上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S组成。三引物在插入突变型线虫上结合位点的位置，如图2示意图所示。进一步地，所述上游引物WT-S设置在所述插入突变的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物WT-A设置在所述插入突变的3’下游200bp-700bp位置，所述第三引物I-S设置在所述插入突变被插入的序列上。进一步地，所述上游引物WT-S与下游引物WT-A以及所述第三引物I-S与下游引物WT-A的G、C碱基百分比相差不超过10％，总碱基个数相差不超过2个碱基，且无引物间二聚体。进一步地，所述上游引物WT-S对和下游引物WT-A组成第一引物对，第三引物I-S和下游引物D-A组成第二引物对，所述第一引物对和第二引物对的退火温度相同。进一步地，所述第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp。进一步地，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段比第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段长100bp-350bp。专利技术人还提供了三引物组用于插入突变纯、杂合线虫的PCR鉴别方法，包括以下步骤：引物设计：利用引物设计软件进行三引物设计，所述三引物为权利要求1-6中任一项所述的上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S，且所述上游引物WT-S和下游引物WT-A组成第一引物对，所述第三引物I-S和下游引物WT-A组成第二引物对；获取需要鉴定的线虫DNA模板；确定最适退火温度：以野生型线虫为模板，分别使用所述第一引物对和第二引物对，进行温度梯度PCR，寻找两个引物对都能PCR扩增出条带正确且亮度合适的退火温度；三引物组PCR：将所述上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S同时加入PCR混合液中，作用于需要鉴定的线虫DNA模板进行竞争性PCR，得到PCR产物；将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析谱图，得出结果。进一步地，所述三引物组PCR步骤中用的PCR体系为：10xpfu扩增缓冲液，1μL；浓度为10mM的dNTP，0.2μL；Pfu高保真酶，0.5μL；浓度为100μM的所述上游引物WT-S，0.05μL；浓度为100μM的所述下游引物WT-A，0.05μL；浓度为100μM的所述第三引物I-S，0.05μL；需要鉴定的线虫DNA模板，0.5μL；重蒸馏水，7.65μL。进一步地，将所述三引物组PCR步骤的工艺条件为：94℃1min30s；94℃20s；最适退火温度20s；72℃1min，以上三个步骤30个循环；72℃5min；18℃保存。区别于现有技术，上述技术方案在二引物组PCR鉴别插入突变纯、杂合线虫的基础上，设计了一个能与下游引物WT-A引物配对的第三引物I-S(请参阅图2)，第三引物I-S可以退火结合在被插入的核苷酸序列上，因此第三引物I-S与下游引物WT-A组成的引物对能以插入突变线虫为模板，扩增出相应大小的片段。图2为本专利技术具体实施方式所述三引物组鉴别插入突变纯、杂合型线虫的PCR方法示意图。如图2所示，第三引物I-S结合在距插入序列3’端300bp的位置，因此第三引物I-S与下游引物WT-A组成的第二引物对能以插入突变线虫为模板，扩增出800bp的条带。对于纯合插入突变模板，虽然也能被上游引物WT-S和下游引物WT-A组成的第一引物对结合并扩增出1864bp的条带，但是因为扩增长度长，竞争不过由第三引物I-S与下游引物WT-A组成的第二引物对的扩增效率，得到的终产物主要为长度800bp的条带。对于杂合插入突变型模板，理论上其包含了一半野生型模板和一半插入型模板。如图2所示，由第三引物I-S与下游引物WT-A组成的第二引物对以插入突变型为模板扩增出800bp条带，但由第三引物I-S与下游引物WT-A组成的第二引物对不能结合野生型模板并扩增。由上游引物WT-S和下游引物WT-A组成的第一引物对以插入突变型扩增出18本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组，其特征在于，所述三引物组由上游引物WT‑S、下游引物WT‑A和第三引物I‑S组成。

【技术特征摘要】
1.准确鉴别插入突变纯、杂合线虫的三引物组，其特征在于，所述三引物组由上游引物WT-S、下游引物WT-A和第三引物I-S组成。2.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S设置在所述插入突变的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物WT-A设置在所述插入突变的3’下游200bp-700bp位置，所述第三引物I-S设置在所述插入突变被插入的序列上。3.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S与下游引物WT-A以及所述第三引物I-S与下游引物WT-A的G、C碱基百分比相差不超过10％，总碱基个数相差不超过2个碱基，且无引物间二聚体。4.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物WT-S对和下游引物WT-A组成第一引物对，第三引物I-S和下游引物D-A组成第二引物对，所述第一引物对和第二引物对的退火温度相同。5.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp。6.根据权利要求5所述的三引物组，其特征在于，所述第二引物对扩增插入突变模板DNA后得到的片段比第一引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段长100bp-350bp。7.三引物组用于插入突变纯、杂合线虫的PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：引物设计：利用引物设计软件进...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵培，康雅虹，廖加磊，
申请(专利权)人：苏州上源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32