食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性评价方法技术

本发明专利技术公开了一种评价食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的方法，包括使用不同浓度的食醋中荧光纳米粒子处理大鼠大鼠肾小管上皮细胞，测定细胞存活率；选择使NRK细胞存活率达到50％～90％的食醋荧光纳米粒子的浓度作为潜在危险浓度，检测细胞凋亡情况；使用细胞存活率达到90％以上的安全浓度进行NRK细胞成像实验，观察食醋中荧光纳米粒子在细胞中的分布情况；通过给BALB/c小鼠灌胃食醋中荧光纳米粒子，经过不同时间处理后，观察食醋中荧光纳米粒子在小鼠体内的分布；最后通过溶血实验测定食醋荧光纳米粒子对小鼠血红细胞的破坏程度。本发明专利技术为食醋中荧光纳米粒子的安全性提供了可靠的科学依据，也为其他纳米材料的安全性评价提供参考。

【技术实现步骤摘要】
食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性评价方法
本专利技术涉及一种食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的评价方法。
技术介绍
食品在加工过程中，原料中的有机分子和低聚物受热发生一系列反应，这与化学合成中通过水热/溶剂热法合成荧光纳米粒子的过程类似，食醋主要由高粱、大曲、麸皮、谷康等原料经糊化、发酵、熏醅等工艺酿制而成，在生产过程中存在无可避免地对原料进行加热的过程，在此过程中，谷物原料中的蛋白质和多糖被降解为短肽链、氨基酸和寡糖，这些物质之间相互发生反应，形成了食醋中的荧光纳米粒子，这种荧光纳米粒子是由分散的类球状碳颗粒组成，尺寸极小，10nm以下，其含有的主要元素为碳（C）、氢（H）、氧（O）、氮（N），主要化学结构有羟基（-OH），羧基（-COOH），羰基（-C=O）和氨基（-NH2）等，它还具有良好的水溶性且其水溶液在365nm紫外光照射下能发出明亮的蓝色荧光，故称之为荧光纳米粒子。食品纳米粒子安全问题一直是人们关注的焦点，食醋作为日常生活中必不可少的调味品，对其安全性的研究十分重要，目前，人们对含有新型荧光纳米粒子的食品的看法通常是负面的，然而在世界上任何一个地方，都还没有关于食品中荧光纳米粒子的强制性标签，消费者很难了解荧光纳米粒子的相关信息，也不确定在商业化的产品中是否存在荧光纳米粒子，因此，对食醋中荧光纳米粒子的体内分布情况以及生物安全性研究十分重要。目前，报导的对于纳米材料的安全性的评价方法包括构建细胞模型与动物模型，观察纳米材料在细胞中的分布和对细胞增殖能力以及凋亡情况的影响，寻找纳米材料影响细胞增殖与凋亡的原因，全面解析纳米材料在细胞水平的生物安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种评价食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的方法。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：一种评价食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的方法，包括以下步骤：A、将大鼠肾小管上皮细胞接种在细胞培养基中培养，待大鼠肾小管上皮细胞生长至对数期时进行消化，消化后的大鼠肾小管上皮细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞；B、将食醋中荧光纳米粒子分散在细胞培养基中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液；C、将步骤B中的荧光纳米粒子溶液梯度稀释成若干浓度为1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL，分别加入到步骤A得到的贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞中，培养24h；D、将培养后的大鼠肾小管上皮细胞在100μL四氮唑蓝溶液中继续培养，向四氮唑蓝溶液培养后的大鼠肾小管上皮细胞中加入200μL二甲基亚砜，在492nm波长下测定吸光值，作为实验组结果，设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、四氮唑蓝溶液和二甲基亚砜溶液处理后，492nm波长下测定吸光值，作为实验组结果测得的吸光度值，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞存活率；E、用步骤D中得到的潜在危险浓度的食醋荧光纳米粒子溶液，浓度梯度为0.2mg/mL和0.4mg/mL；处理步骤A中消化后的对数期大鼠肾小管上皮细胞24h，经胰酶消化后形成单细胞悬液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后离心，加入流式细胞缓冲液，测定细胞的生存情况，设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液和流式细胞缓冲溶液处理后测得的细胞生存情况，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞凋亡率；F、将幼鼠分为两组，对照组和实验组，将食醋中荧光纳米粒子分散在超纯水中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液，小鼠口服的暴露剂量为2gkg-1体重，实验组小鼠口服荧光纳米粒子溶液，对照组小鼠口服NaCl水溶液，分别取对照组和实验组口服不同时间的小鼠主要器官观察食醋荧光纳米粒子在小鼠器官中的积累情况；G、将食醋中荧光纳米粒子分散在磷酸盐缓冲溶液中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液并梯度稀释成若干浓度，进行小鼠灌胃试验；试验采用的是4-5周龄雄性小鼠，荧光纳米粒子的浓度为2gkg-1×小鼠体重（kg）/400μL；小鼠主要器官包括胃、肠、肾、肝、肺和脑。H、取对照组小鼠血液，将血液离心除去血清获得血红细胞，离心的参数设置为4℃，3500rpm，15min；用磷酸盐缓冲溶液冲洗后备用，在细胞培养液中加入步骤G中得到的荧光纳米粒子溶液，浓度梯度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和20mg/mL；室温培养120min，阴性对照组为仅向细胞培养液中加入等体积磷酸盐缓冲溶液以细胞形态维持不变，阳性对照组为仅加入等体积超纯水使细胞破裂，120min孵育之后离心取上清液在541nm处测吸光度；I、根据以上试验综合评价食醋中荧光纳米粒子的生物分布和生物安全性。本专利技术一种评价食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的方法，原料廉价易购；荧光纳米粒子制备方法简单，试验重复性好；通过细胞试验与初步动物试验对食醋中荧光纳米粒子进行体内分布情况与生物安全性研究，以此评价食醋中荧光纳米粒子的安全性，并建立食醋中荧光纳米粒子安全性的评价方法，为食醋中荧光纳米粒子安全评价提供方法。附图说明图1是本专利技术实施例1中食醋荧光纳米粒子MTT试验细胞存活率图。图2是本专利技术实施例2中食醋荧光纳米粒子细胞凋亡实验结果图。图3是本专利技术实施例4中食醋荧光纳米粒子在小鼠体内分布情况图。图4是本专利技术实施例5中食醋荧光纳米粒子溶血实验结果图。图5是本专利技术实施例5中食醋荧光纳米粒子对血红细胞形态影响结果图。具体实施方式评价食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的方法，具体步骤为：A、将大鼠肾小管上皮细胞NRK接种在细胞培养基（DMEM）中培养，待大鼠肾小管上皮细胞NRK生长至对数期时进行消化，消化后的大鼠肾小管上皮细胞NRK悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的NRK细胞；B、将食醋中荧光纳米粒子分散在DMEM中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液；C、将步骤B中的荧光纳米粒子溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到步骤A得到的贴壁生长的NRK细胞中，培养24h，荧光纳米粒子的浓度梯度为0-20mg/mL；D、将培养后的NRK细胞在100µL四氮唑蓝（MTT）溶液中继续培养，向MTT溶液培养后的NRK细胞中加入200µL二甲基亚砜（DMSO），492nm波长下测定吸光值，作为实验组结果；设置对照组，对照组的结果为将NRK细胞依次经DMEM、MTT溶液和DMSO溶液处理后测得的吸光度值；将实验组结果和实验对照组结果代入公式计算得到细胞存活率：细胞存活率=ODexp/ODcon×100％，其中ODexp代表实验组吸光度值，ODcon代表实验对照组吸光度值，根据实验组中细胞存活率在50％～90％所用食醋荧光纳米粒子溶液的浓度作为食醋荧光纳米粒子的潜在危险浓度；E、用步骤D中得到的潜在危险浓度的食醋荧光纳米粒子溶液处理步骤A中消化后的对数期NRK细胞24h，经胰酶消化后形成单细胞悬液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗两次后离心，加入流式细胞缓冲液，测定细胞的生存情况，设置对照组，对照组的结果为将NRK细胞依次经DMEM、PBS溶液和流式细胞缓冲溶液处理后测得的细胞生存情况；将实验组结果和实验对照组结果代入公式计算得到细胞凋亡率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将大鼠肾小管上皮细胞接种在细胞培养基中培养，待大鼠肾小管上皮细胞生长至对数期时进行消化，消化后的大鼠肾小管上皮细胞悬液进行贴壁培养24 h，得到贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞；B、将食醋中荧光纳米粒子分散在细胞培养基中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液；C、将步骤B中的荧光纳米粒子溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到步骤A得到的贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞中，培养24 h；D、将培养后的大鼠肾小管上皮细胞在四氮唑蓝溶液中继续培养，向四氮唑蓝溶液培养后的大鼠肾小管上皮细胞中加入二甲基亚砜，在波长下测定吸光值，作为实验组结果，设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、四氮唑蓝溶液和二甲基亚砜溶液处理后测得的吸光度值，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞存活率；E、用步骤D中得到的潜在危险浓度的食醋荧光纳米粒子溶液处理步骤A中消化后的对数期大鼠肾小管上皮细胞24 h，经胰酶消化后形成单细胞悬液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后离心，加入流式细胞缓冲液，测定细胞的生存情况；设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液和流式细胞缓冲溶液处理后测得的细胞生存情况，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞凋亡率；F、将幼鼠分为两组，对照组和实验组，将食醋中荧光纳米粒子分散在超纯水中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液，小鼠口服的在一定浓度条件下暴露，实验组小鼠口服荧光纳米粒子溶液，对照组小鼠口服NaCl水溶液，分别取对照组和实验组口服不同时间的小鼠主要器官观察食醋荧光纳米粒子在小鼠器官中的积累情况；G、将食醋中荧光纳米粒子分散在磷酸盐缓冲溶液中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液并梯度稀释成若干浓度；H、取对照组小鼠血液，将血液离心除去血清获得血红细胞，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后备用，在细胞培养液中加入步骤G中得到的荧光纳米粒子溶液，室温培养120 min，阴性对照组为仅向细胞培养液中加入等体积磷酸盐缓冲溶液以细胞形态维持不变，阳性对照组为仅加入等体积超纯水使细胞破裂，120 min孵育之后离心取上清液在541 nm处测吸光度；I、根据以上试验综合评价食醋中荧光纳米粒子的生物分布和生物安全性。...

【技术特征摘要】
1.一种食醋中荧光纳米粒子体内分布和生物安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将大鼠肾小管上皮细胞接种在细胞培养基中培养，待大鼠肾小管上皮细胞生长至对数期时进行消化，消化后的大鼠肾小管上皮细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞；B、将食醋中荧光纳米粒子分散在细胞培养基中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液；C、将步骤B中的荧光纳米粒子溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到步骤A得到的贴壁生长的大鼠肾小管上皮细胞中，培养24h；D、将培养后的大鼠肾小管上皮细胞在四氮唑蓝溶液中继续培养，向四氮唑蓝溶液培养后的大鼠肾小管上皮细胞中加入二甲基亚砜，在波长下测定吸光值，作为实验组结果，设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、四氮唑蓝溶液和二甲基亚砜溶液处理后测得的吸光度值，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞存活率；E、用步骤D中得到的潜在危险浓度的食醋荧光纳米粒子溶液处理步骤A中消化后的对数期大鼠肾小管上皮细胞24h，经胰酶消化后形成单细胞悬液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后离心，加入流式细胞缓冲液，测定细胞的生存情况；设置对照组，对照组的结果为将大鼠肾小管上皮细胞依次经细胞培养基、磷酸盐缓冲溶液和流式细胞缓冲溶液处理后测得的细胞生存情况，通过实验组结果和对照组结果计算得到细胞凋亡率；F、将幼鼠分为两组，对照组和实验组，将食醋中荧光纳米粒子分散在超纯水中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液，小鼠口服的在一定浓度条件下暴露，实验组小鼠口服荧光纳米粒子溶液，对照组小鼠口服NaCl水溶液，分别取对照组和实验组口服不同时间的小鼠主要器官观察食醋荧光纳米粒子在小鼠器官中的积累情况；G、将食醋中荧光纳米粒子分散在磷酸盐缓冲溶液中，漩涡震荡，得到荧光纳米粒子溶液并梯度稀释成若干浓度；H、取对照组小鼠血液，将血液离心除去血清获得血红细胞，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后备用，在细胞培养液中加入步骤G中...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭明乾，曹林，李加齐，铁珊珊，丛爽，张雪迪，乔凤至，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21