一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法技术

一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法,包括步骤：(1)将无菌的油菜外植体用野生型和含有GUS基因的农杆菌K599侵染；(2)侵染后的外植体放入无抗MS固体培养基上黑暗条件下进行共培养；(3)共培养后的外植体移至诱导培养基中培养；(4)将诱导产生的油菜毛状根进行继代和扩增培养。(5)对含有GUS基因的毛状根进行GUS染色探究转化效率。本发明专利技术对影响埃塞俄比亚油菜毛状根诱导外植体预培养、侵染、共培养的时间和侵染液浓度进行探究，以及对转基因的毛状根进行GUS染色鉴定,通过鉴定颜色探究转化效率，实现了油菜毛状根快速的诱导。本发明专利技术方法适用于多种油菜品种毛状根的诱导,取材方便、适用性强、诱导速度快。

【技术实现步骤摘要】
一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法
本专利技术涉及农业应用生物
，特别是提供一种对油菜毛状根快速诱导的方法。
技术介绍
油菜在进行基因功能验证的方法中，一般采用油菜外植体诱导愈伤再生体系，该技术实验周期较长而且转化效率比较低。但是油菜毛状根具有生长周期短，便于培养，易于转化、转化率高等优点。目前，黄籽油菜育种是当代油菜育种的热点，对油菜中种皮基因的克隆和基因功能验证就尤为重要。因此油菜的毛状根诱导和基因转化效率十分必要，同时可以利用转入毛状根中GUS基因，对其进行GUS染色鉴定转化效率，这对利用油菜毛状根有着十分重要的意义。油菜外植体用发根农杆菌诱导毛状根，其中发根农杆菌菌种是关键物质。K599是发根农杆菌一种，已有文献报道可以诱导植物发根。发根农杆菌诱导植物产生毛状根的产生是一个复杂的过程，与之含有的Ri质粒有着密切的关系,主要是由Ri质粒中Ori区、Vir区及T-DNA区三部分共同作用的结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法。本专利技术采用的技术方案：一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法,是将2-3周的埃塞俄比亚油菜无菌苗，分别用侵染液A和侵染液B侵染5-10分钟，然后进行共培养,24-48小时后，转移到筛选培养基中进行培养，一周以后从外植体中剪下生长快速的毛状根，转移到继代培养基上，二周以后转移到液体培养基上进行扩大培养，一个月以后得到大量毛状根；所述的侵染液A为野生型发根农杆菌K599，侵染液B为转入GUS报告基因的发根农杆菌K599。所述的侵染液A由OD值(600）0.8发根农杆菌K599进行离心用等体积MS液体进行重悬得到。所述的侵染液B由OD值(600）0.8发根农杆菌K599带有GUS报告基因进行离心用等体积MS液体进行重悬得到。本专利技术有益效果：本专利技术采用OD值为0.8的野生型发根农杆菌K599对埃塞俄比亚油菜进行诱导，能高效诱导出大量毛状根；并且，诱导出的毛状根中带有GUS报告基因，能被染成蓝色。从而能采用化学染色法简便、直观探究出埃塞俄比亚油菜的诱导转化效率。专利技术方法操作简单，分析速度快，使用试剂价格低廉。具体实施方式实施例1:一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法，包括步骤：（1）侵染液A：由50mlOD值(600）0.8发根农杆菌K599进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（2）侵染液B：50mlOD值(600）0.8发根农杆菌K599带有GUS报告基因进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（3）取两瓶2周龄的的黑籽埃塞俄比亚油菜，剪段。（4）一组加入到50毫升侵染液A，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液B中。（5）放入MS固体培养基上，25℃暗培养48h。（6）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的MS固体培养基中，培养两周到三周以后，下胚轴和子叶分化形成毛状根。（7）剪去2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢MS固体培养基上进行筛选培养。两周以后筛选出生长速度快的油菜毛状根，在含50mg/ml头孢的MS固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的油菜毛状根。（8）剪去2-3cm状根，在加入MS液体培养基上进行扩大培养，得到生长快,侧根分支多的油菜毛状根。（9）对B侵染液侵染并培养的埃塞俄比亚油菜进行GUS染色，发现变蓝。实施例2:一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法，包括步骤：（1）侵染液A：由50mlOD值(600）0.8农杆菌K599进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（2）侵染液B：50mlOD值(600）0.8农杆菌K599带有GUS报告基因进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到，混匀备用。（3）取两瓶2周龄黄籽埃塞俄比亚油菜，剪段。（4）一组加入到50毫升侵染液A，使外植体完全浸泡在液体中，侵染5-10分钟。另外一组加入到50毫升侵染液B中。（5）放入MS固体培养基上，25℃暗培养48h。（6）共培养结束以后，转移至含有100mg/ml头孢的MS固体培养基上，培养两周到三周以后，下胚轴和子叶分化形成毛状根。（7）剪去2-3cm毛状根，在加入100mg/ml头孢MS固体培养基上进行筛选培养。两周以后筛选出生长速度快的油菜毛状根，在含50mg/ml头孢的MS固体培养基上进行继代培养。继代培养2-3次以后，得到脱毒的油菜毛状根。（8）剪去2-3cm毛状根，在加入MS液体培养基上进行扩大培养，得生长快,侧根分支多的油菜毛状根。（9）对B侵染液侵染并培养的黄籽埃塞俄比亚油菜进行GUS染色，发现变蓝。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法,其特征是：将2‑3周龄的埃塞俄比亚油菜无菌苗，分别用侵染液A和侵染液B侵染5‑10分钟，然后进行共培养,24‑48小时后，转移到筛选培养基中进行培养，一周以后从外植体中剪下生长快速的毛状根，转移到继代培养基上，二周以后转移到液体培养基中进行扩大培养，一个月以后得到大量毛状根；所述的侵染液A为野生型发根农杆菌K599，侵染液B为转入GUS报告基因的发根农杆菌K599。

【技术特征摘要】
2018.11.14 CN 20181134921591.一种快速诱导埃塞俄比亚油菜毛状根的方法,其特征是：将2-3周龄的埃塞俄比亚油菜无菌苗，分别用侵染液A和侵染液B侵染5-10分钟，然后进行共培养,24-48小时后，转移到筛选培养基中进行培养，一周以后从外植体中剪下生长快速的毛状根，转移到继代培养基上，二周以后转移到液体培养基中进行扩大培养，一个月以后得到大量毛状根；所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秉良，李世娟，程成，李隆，刘蓓，岳东晓，姚军胜，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62