本发明专利技术提供了一种快速高通量选育高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum B1）及应用方法，以谷氨酸棒杆菌为对象，在30‑37℃，100‑200r/min的摇床中培养一定时间后，经过常温常压等离子体（ARTP）诱变处理50‑180s后，接种到0.05‑0.4mg/mL浓度的磺胺胍培养基中30‑37℃培养1‑2天，经过培养后，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行96孔板高通量筛选，可选育出高产菌株Corynebacterium glutamicum B1。该菌株在100mL摇瓶发酵30‑48h的条件下异亮氨酸产量较原始菌株提高了62.03%，且遗传性状稳定。该方法建立了磺胺胍标记初筛和茚三酮多孔板检测的高通量筛选策略，可以广泛应用于高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌高通量选育，提高筛选效率，具有巨大的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌的选育方法及应用
本专利技术涉及一种高产氨基酸的高通量筛选方法，尤其是一种异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌高通量筛选方法，属于生物医药和大健康产业。
技术介绍
L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，国内异亮氨酸的产量还不高，生产技术相对国外还具有较大差距，高产菌株的选育成为异亮氨酸产量提高的重要环节。常温常压等离子体(ARTP)诱变育种技术是由清华大学自主研发的一种微生物基因组快速突变技术。该技术具有成本低、操作简便、安全性高以及等离子体产生条件温和富含大量活性粒子、突变谱广、突变率高等优点，被广泛用于细菌、真菌、微藻等微生物的生物育种。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术使用ARTP诱变仪对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)进行处理，然后通过添加适宜浓度的磺胺胍抗性标记初筛，再将初筛菌株接种至多孔板发酵培养后取上清液进行茚三酮显色反应检测，实现高通量筛选，在国内外还未见报道。本技术专利技术目的首先是建立了一套高通量筛选流程，高产菌株ARTP诱变筛选主要步骤：将原始菌株培养后，先进行ARTP诱变条件的优化，然后通过磺胺胍抗性标记进行初筛，挑选丰度饱满的菌落，接种到多孔板中培养，提取发酵上清液与茚三酮试剂在一定条件下反应，挑选出在OD570下吸光值较大的菌株对应的发酵上清液[7]，进行薄层层析法针对性对照检测，再经摇瓶复筛培养，提取上清液，利用氨基酸分析仪检测其异亮氨酸含量。具体高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，包括如下步骤，其流程见图1。(1)以谷氨酸棒状杆菌为对象，在30-37℃，100-200r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30-180s；(2)待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30-37℃培养1-2天；(3)将步骤(2)得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株CorynebacteriumglutamicumB1。所述的常温常压等离子体诱变的辐射功率为100-120W，氦气流量为3-10L/min，诱变时间为120-150s。所述的磺胺胍培养基中含有0.05-0.4mg/mL的磺胺胍。所述的步骤(3)中菌株与茚三酮采用多孔板进行特异性显色反应，多孔板包括48-96孔板。所述的将多孔板的优势菌株先在种子培养基中，在30-37℃、100-200r/min下培养1-2天；再以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，再在30-37℃、100-200r/min下培养1-2天，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到性能稳定的高产菌株CorynebacteriumglutamicumB1。所述的种子液培养基g/L包括：葡萄糖5-10g/L，蛋白胨1-5g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.03-1g/L；发酵培养基g/L包括：葡萄糖5-10g/L，蛋白胨2-7g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.3-1g/L，酵母浸粉1-5g/L，硫酸铵1-6g/L。针对上述的工艺步骤本专利技术的技术方案系统考察了本方法的ARTP诱变致死率的影响使用不同的时间(0、60、90、120、150、180、210、240s)进行诱变处理，将诱变的菌体放入到1mL的生理盐水中振摇1min，取100uL涂布到平板培养基上37℃培养2天，计算致死率。研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生显著变化，最终导致微生物产生突变。诱变时间和作用强度对微生物致死率的影响较大。致死率过低或过高都不利于筛选。结果见如图2所示。从图2可以看出ARTP对Corynebacteriumglutamicum的杀伤力较大，在60-120s之间呈直线增长方式，在处理时间为120s时致死率达到88％左右，180s的时候致死率达到了98.44％，当处理时间达到240s的时候，菌体基本上全部不能存活。为了保证一定的突变率，选择相应的诱变时间至关重要。实验表明，选择致死率达到95％以上的对应的辐射时间为宜。更进一步的本技术专利技术还系统考察了磺胺胍浓度对菌株抑制率的影响磺胺胍为天冬氨酸的结构类似物，通过选育磺胺胍抗性突变株能遗传性地解决天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制。同时0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/mL等不同浓度的磺胺胍对细胞的抑制程度不同，因此需要优化磺胺胍浓度使筛选效果达到最佳。选取不同的磺胺胍浓度进行研究。不同磺胺胍浓度对Corynebacteriumglutamicum的抑制率如图3所示。从图3可以看出磺胺胍对Corynebacteriumglutamicum的抑制效果明显。在低浓度(0.1mg/mL)时，抑制作用较小，当磺胺胍浓度达到0.3mg/mL时，抑制效果增强，抑制率达到97％左右。当磺胺胍浓度达到0.4mg/mL时，菌体不能生长。为了在能使菌体能够生长的同时又能达到筛选效果，选取0.3mg/mL左右的磺胺胍浓度添加量作为筛选培养基的最佳添加量，用于磺胺胍抗性标记筛选。另外，本专利技术的技术方案进行了优势菌株的高通量筛选由于诱变产生的突变体多，所以需要建立一种高通量的快速筛选方式。先将平板上诱变的菌株用竹签接种到24孔1mL的培养基中，在37℃、300r/min的微孔板恒温摇床中培养，取培养24、36、48h的菌液离心取上清液20μL至96圆孔深孔板中，每个孔板加入240μL0.5％的茚三酮溶液，70℃水浴8min，然后冷却至室温，用酶标仪测其吸光度，以没有添加茚三酮溶液的吸收光强度为空白对照，筛选出氨基酸含量较高的突变株。并将诱变菌株在平板培养基上连续传代10次，再进行发酵培养，检测菌株的产酸能力，研究其遗传稳定性。图4显示了以原始菌株吸光强度为1.0时，42个诱变菌株培养48h时的相对吸光强度。由图可见，大多数诱变菌株的相对吸光强度高于原始菌株，有三株诱变菌株B1、D6、E5的相对吸光值高于原始菌株20％以上，将诱变菌株B1、D6、E5和原始菌株W进行摇瓶发酵培养，利用氨基酸分析仪检测48h时的异亮氨酸产量。复筛结果如表1。表1谷氨酸棒状杆菌诱变复筛的结果由表1可以看出，诱变菌株B1、D6、E5的摇瓶复筛产量相对原始菌株而言，依然表现出较好的异亮氨酸生产性能，其产量分别增加了62.03％、30.89％、14.19％。由此可见本实验的筛选方法是行之有效的。最后，本专利技术的技术方案得到的菌株进行了遗传稳定性考察为了检验优势诱变菌株CorynebacteriumglutamicumB1能否保持稳定的遗传特性，将诱变菌株B1连续传代培养10次，并同时进行发酵培养，检测发酵上清液在570nm下的吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以谷氨酸棒杆菌为对象，在30‑37℃，100‑200 r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30‑180 s；（2）待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30‑37 ℃培养1‑2天；（3）将步骤（2）得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株，即高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum B1。
【技术特征摘要】
1.一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以谷氨酸棒杆菌为对象，在30-37℃，100-200r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30-180s；（2）待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30-37℃培养1-2天；（3）将步骤（2）得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株，即高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌CorynebacteriumglutamicumB1。2.根据权利要求1所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，其特征在于，常温常压等离子体诱变的辐射功率为100-120W，氦气流量为3-10L/min，诱变时间为120-150s。3.根据权利要求1所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌选育方法，其特征在于，磺胺胍培养基中含有0.05-0.4mg/mL的磺胺胍。4.根据权利要求1所述的高产异亮氨酸的谷...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚大春，孔帅，吕育财，郑美娟，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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